Dispositif de chambre de flux en trois dimensions est une nouvelle<em> In vitro</em> Technologie pour l'évaluation quantitative et progressive de la cascade de l'extravasation des cellules circulantes dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique. Le dispositif vient donc combler un besoin critique pour les études de base, préclinique, clinique et de la migration cellulaire.
L'extravasation des cellules du sang circulant joue un rôle central dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques, y compris les cellules souches métastases homing et de la tumeur. Le dispositif de chambre écoulement tridimensionnel (ci-après le dispositif 3D) est une nouvelle technologie in vitro qui reproduit la contrainte de cisaillement physiologique et permet à chaque étape de la cascade de l'extravasation des cellules à quantifier. Dispositif 3D consiste en un compartiment supérieur dans lequel les cellules d'intérêt circulent sous contrainte de cisaillement, et un compartiment inférieur de puits statiques qui contiennent des facteurs chimiotactiques d'intérêt. Les deux compartiments sont séparés par des inserts poreux revêtu d'une monocouche de cellules endothéliales (EC). Un second insert en option avec les cellules du microenvironnement d'intérêt peut être placé immédiatement sous la couche CE. Un appareil d'échange de gaz permet à l'optimal tension de CO 2 pour être maintenu et fournit un point d'accès pour ajouter ou retirer des cellules ou des composés au cours de l'expérience. Les cellules de test circulent dans le compartiment supérieur à la contrainte de cisaillement souhaitée (débit) contrôlée par une pompe péristaltique. A la fin de l'expérience, les cellules circulantes et migré sont collectés pour des analyses plus poussées. Le dispositif 3D peut être utilisé pour examiner cellule rouler sur et l'adhésion à la CE sous la contrainte de cisaillement, transmigration en réponse aux gradients de chimiokines, la résistance au cisaillement, la formation de grappes, et la survie cellulaire. En outre, le second insert en option permet des effets de diaphonie entre la CE et les cellules du microenvironnement à examiner. Les applications de translation du dispositif 3D comprennent des tests de médicaments candidats que la migration de la cellule cible et prédire le comportement in vivo des cellules après injection intraveineuse. Ainsi, le dispositif de 3D roman est un outil polyvalent et peu coûteux d'étudier les mécanismes moléculaires qui interviennent dans extravasation cellulaire.
extravasation des cellules est le processus par lequel les cellules circulantes quittent la circulation sanguine et est une composante essentielle de nombreuses réactions physiologiques dans l'organisme. Le processus est aussi important pour la régénération des tissus, comme par exemple, lorsque les cellules thérapeutiques mobilisés à partir de tissus dans les vaisseaux sanguins (ou injecté par voie intraveineuse) migrent à travers le système vasculaire et sortent de la circulation sur les sites de blessure ou de dégénérescence. Extravasation est également une composante essentielle de la pathogenèse de nombreuses maladies, y compris l'inflammation, le rejet immunitaire, l'auto-immunité, et la métastase des tumeurs.
Extravasation est un processus à plusieurs étapes complexe qui implique l'interaction de cellules avec des cellules endothéliales (EC) circulant dans des conditions d'écoulement physiologique. Le procédé consiste à (a) de roulement de la cellule, (b) l'adhésion ferme à la surface luminale des CE, et (c) la transmigration à travers la CE. Surtout, chaque étape de la cascade d'extravasation est régulée par un sous-ensemble de cell spécifique au type et des molécules spécifiques à l'espèce. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillées qui régissent l'extravasation des sous-ensembles de cellules spécifiques sont pas bien comprises, en grande partie en raison de la difficulté technique de rappeler les conditions dans le sang. Le dispositif 3D roman décrit ici est conçu pour surmonter ces défis techniques et permettre d'effectuer des essais qui permettront d'améliorer notre compréhension de la biologie de la migration cellulaire.
Les molécules qui interviennent dans la migration cellulaire sont des cibles thérapeutiques importantes. Une compréhension détaillée des événements moléculaires qui contrôlent la migration des types cellulaires spécifiques aidera à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la promotion ou l'inhibition de l'extravasation. Par exemple, les interventions qui améliorent la migration des cellules souches thérapeutiques (qu'elles dérivent de tissus fœtaux adultes, néonatale ou même d') vers des sites de lésion ou de la dégénérescence serait d'une grande utilité dans la régénération tissulaire.Il ya un intérêt croissant pour la production in vitro de cellules souches thérapeutiques, y compris les cellules dérivées de sources pluripotentes, et dans des cellules ex vivo manipulés souches adultes (élargi, manipulé génétiquement et prétraité avec différentes enzymes) 1. Ainsi, il existe un besoin pour de nouvelles technologies à évaluer la qualité des cellules souches avant qu'ils ne soient utilisés à des fins thérapeutiques. Parmi les autres paramètres, les cellules doivent être en mesure de sortir efficacement la circulation, car les traitements pour les troubles multifocales peuvent nécessiter une administration intraveineuse des cellules souches 2. En effet, l'un des défis actuels de la biologie des cellules souches est de remédier à la très faible efficacité avec laquelle les cellules souches maison aux sites des lésions tissulaires 3-6, soulignant la nécessité de combler cette lacune dans notre compréhension de la migration des cellules souches. En revanche, les stratégies que la migration des cellules de bloc en ciblant des molécules spécifiques homing serait utile pour le traitement de l'enmaladies inflammatoires et auto-immunes ainsi que le cancer métastatique. Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires qui interviennent dans les interactions entre les cellules circulantes et la CE au cours de la migration cellulaire et extravasation est pertinent pour la médecine translationnelle et la découverte de médicaments ainsi que de la science fondamentale.
Il ya actuellement un certain nombre de méthodes disponibles pour étudier les différents aspects de la migration cellulaire. Cependant, ces méthodes présentent des inconvénients qui peuvent être surmontés avec le nouveau dispositif 3D.
Les modèles animaux:
Les modèles animaux, tels que des souris immunodéprimées et les souris génétiquement manipulées, ont été des outils utiles pour étudier la migration des cellules humaines in vivo. Cependant, un inconvénient important pour ces modèles est que les cellules humaines interagissent faiblement avec les molécules d'adhésion présentes sur les souris CE, en partie à cause des différences de séquences spécifiques d'espèces dans de nombreuses molécules de surface cellulaire. Ainsi, l'utilisation des rongeurs pour étudiermigration cellulaire humaine est peu susceptible de refléter authentiquement les événements de lits vasculaires spécifiques d'organes humains. En outre, dans des modèles in vivo ne sont pas adaptés pour le criblage à haut débit de candidats-médicaments. Le classique des modèles in vivo à l'aide d'étudier cellule homing ne discriminent pas entre les différentes étapes de la cascade d'extravasation, il est difficile d'identifier et de cibler de nouvelles molécules à tête chercheuse. L'approche de microscopie intravitale a été développé pour répondre à ce besoin et a été instructif, mais cette technique demande beaucoup de temps et de main-d'œuvre 7,8.
Dosages de transmigration statiques:
Transwell ou Boyden chambre essais migration des cellules de mesure à travers une membrane poreuse et sont largement utilisés dans les études sur la migration. Le test a l'avantage qu'il peut être utilisé pour étudier non seulement la motilité cellulaire et la matrice des interactions cellule-extracellulaire (MEC), mais aussi la migration chimiokine médiée par des cellulesà travers une monocouche CE cultivées sur des membranes poreuses. Malheureusement, le phénotype et la fonction des CE dans des conditions statiques diffèrent sensiblement de ceux sous flux physiologique 9,10. Ainsi, les événements chimiotactiques qui se produisent dans des dosages TRANSWELL ne fidèlement imiter les interactions entre les cellules migrantes et des CE au titre de la contrainte de cisaillement. En outre, l'étape de «roulement» de la cascade homing, ce qui ajoute une dimension supplémentaire de la sélectivité à l'ensemble du processus, ne se produit pas dans des essais statiques TRANSWELL. Ainsi, alors que cette technologie ne permettra l'évaluation quantitative de la migration cellulaire chimiokine induite à travers la monocouche CE, elle est limitée par son incapacité à fournir la contrainte de cisaillement qui imite le flux sanguin in vivo.
Des essais sous contrainte de cisaillement:
Mur contrainte de cisaillement est connue pour jouer un rôle important dans la régulation de la fonction CE 9,10. Les forces de cisaillement induisent une activation rapide des cascades de signalisation, transcLes facteurs de Ription, et l'expression différentielle des gènes dans l'affaire CE 11,12. Cette information a conduit au développement de la prochaine génération de tests d'adhésion – chambres à flux laminaire parallèles et capillaires – étudier roulement et l'adhérence des cellules à la CE dans des conditions de contrainte de cisaillement 7,13. Le facteur limitant pour ces tests est qu'ils peuvent mesurer seulement de roulement et l'adhérence, mais ne fait pas de différence entre une cellule adhérente qui irait à transmigrer et une cellule adhérente qui est «arrêté» sur la monocouche CE et ne serait pas transmigrer. De plus, ces tests ne peuvent pas mesurer la migration des cellules vers un gradient de chimiokine.
Plusieurs rapports ont décrit la capacité des cellules adhérentes à ramper sous une monocouche CE cultivées sur des lames de verre dans des conditions d'écoulement 14. Les limites de cette technique ramper comprennent: il analyse seulement un nombre limité de cellules, c'est non quantitative, il analyse cellulaire rampant sur la matrice et celL surface mais pas la migration vers un gradient chimiotactique, et il ne permet pas aux cellules transmigré à être isolés. Ainsi, bien que ce test a l'avantage de l'application de la contrainte de cisaillement à la monocouche CE, il ne peut pas quantifier la migration des cellules vers un gradient de chimiokine.
La technologie 3D roman décrit ici surmonte un grand nombre de ces lacunes en combinant la force de cisaillement (compartiment supérieur) avec un gradient de chimiokine statique (compartiment inférieur) et permet une évaluation quantitative de chaque étape de la cascade d'extravasation (Figure 1). Le dispositif peut également être utilisé pour étudier comment la diaphonie entre la CE et le microenvironnement influe sur la capacité de la CE à soutenir extravasation des cellules circulantes. Le protocole suivant décrit la méthode étape par étape pour l'utilisation du dispositif de chambre de flux 3D.
Le dispositif 3D peut être une technologie utile pour la recherche dans divers domaines, notamment la biologie des cellules souches, la biologie vasculaire, l'hématologie, l'oncologie, l'auto-immunité et l'inflammation. Le dispositif 3D sera particulièrement utile pour les chercheurs qui étudient les cellules hématopoïétiques, mésenchymateuses, neurales, et d'autres souches d'étudier les mécanismes moléculaires régulant chaque étape de la cascade de l'extravasation des cellules souches. Les chercheurs qui étudient la migration des cellules peuvent également utiliser cet appareil pour étudier les différents mécanismes de migration des T et des lymphocytes B, les monocytes, les neutrophiles, éosinophiles, des cellules NK et d'autres cellules migratrices. En biologie vasculaire, l'appareil sera utile pour évaluer l'effet du micro-environnement local sur la capacité de la CE à soutenir le recrutement de cellules et d'imiter la barrière hémato-encéphalique in vitro. Pour les chercheurs se concentrant sur la pathogenèse de la maladie, le dispositif peut être utilisé pour étudier la migration des cellules T cytotoxiques dans le pancréas au cours du diabète de type I, le migration des éosinophiles dans les poumons des patients asthmatiques, la migration des neutrophiles, monocytes et lymphocytes dans les sites d'inflammation dans une variété de troubles, le recrutement des cellules de blesser les sites de guérison, l'interaction des cellules T cytotoxiques avec la néovascularisation, et le recrutement des lymphocytes T cytotoxiques dans les tumeurs.
Le dispositif 3D roman sera également un outil utile pour la science translationnelle et pour le développement préclinique de médicaments et de dépistage. Par exemple, le dispositif peut être utilisé pour optimiser la préparation des suspensions cellulaires thérapeutiques administrées par voie intraveineuse, pour tester le recrutement de cellules thérapeutiques pour les tissus blessés contre les tissus normaux, et d'examiner le rôle de l'organe spécifique ou endothélium des tissus et microenvironnement dans cette processus. Pour le développement de médicaments, le dispositif pourrait être utilisé pour tester des médicaments candidats que les cellules tumorales cibles et bloquer chaque étape de la cascade d'extravasation, pour tester les cellules qui migrent comme une drogue livrery véhicule des sites tumoraux, pour tester des médicaments qui régulent la fonction de l'endothélium spécifique d'un organe humain ou le microenvironnement spécifique du tissu local, et de tester des combinaisons de médicaments qui régulent les différentes étapes de la cascade homing. Enfin, lorsqu'il est converti en un système à haut débit, l'appareil peut être utilisé pour le criblage de petites molécules, des peptides, et des anticorps qui molécules cibles de médiation du trafic de la cellule.
Détails techniques et astuces
Roulement et l'adhérence sous flux sont les étapes critiques dans la cascade d'extravasation et contribuent de manière significative à l'efficacité de la migration cellulaire in vivo. Notamment, ces mesures ne contribuent pas à des essais statiques in vitro. Cependant, les dosages de transmigration statiques sont utiles comme témoins négatifs en expériences testant les effets de la contrainte de cisaillement sur la survie cellulaire et la fonction, y compris la capacité de la CE à soutenir les interactions faible affinité (roulement) et une bonne adhérence.
Le choix du support pour les expériences dans le dispositif 3D est important. Médias contiennent différents facteurs de croissance qui peuvent influer sur la survie des cellules circulantes, en particulier pendant les périodes d'incubation. En outre, les concentrations de Ca 2 + et Mg 2 +, qui peuvent influencer les interactions adhésives dans des conditions d'écoulement physiologique, varier considérablement dans les milieux de culture commerciale. Autres détails techniques qui devraient être prises en compte lors de la planification des expériences avec le dispositif 3D sont discutés ci-dessous.
Sélection de la monocouche CE
La signature de la CE à la surface cellulaire est influencée par divers paramètres, y compris les espèces et les tissus d'origine et les conditions de culture de cellules, ce qui devrait être pris en compte dans la conception expérimentale. Certains couramment utilisée CE comprennent poumon dérivé microvasculaire CE (LDMVEC), dérivées de moelle osseuse CE (BMDEC), CE (brain-derived BDEC), et HUVEC.Les propriétés de la CE varient aussi avec leur origine. Par exemple, BMDEC expriment constitutivement sélectines et VCAM-1, qui sont responsables de roulement et l'adhérence, tandis que BDEC, LDMVEC et HUVEC n'expriment pas ces molécules dans des conditions normales. Par conséquent, inserts revêtus de BDEC, LDMVEC et HUVEC peuvent être prétraités avec le TNF α (10 ng / ml, 4 heures) ou d'autres facteurs pour imiter l'inflammation et induire l'expression de molécules à tête chercheuse.
Test de diaphonie avec le micro-environnement local
Il ya un intérêt croissant pour comprendre comment le micro-environnement local régule les fonctions du CE et participe à l'extravasation des cellules. Nos résultats démontrent que l'insertion d'une monocouche de cellules stromales sous la monocouche CE augmente considérablement extravasation des cellules circulantes. Cette constatation démontre que la diaphonie entre la CE et le stroma améliore la capacité de la CE pour soutenir extravasation des cellules circulantes. Moreover, l'insertion de cellules de différents micro-environnements (par exemple, cellules souches mésenchymateuses, des fibroblastes de poumon, des cellules tumorales, les astrocytes) pourrait permettre d'imiter lits vasculaires spécifiques. En particulier, une combinaison de CE et astrocytes dérivé du cerveau pourrait être une approche utile pour imiter la barrière hémato-encéphalique. De même, les cellules obtenues à partir de patients, ou des cellules normales manipulées in vitro, pourraient contribuer à imiter un microenvironnement spécifique malade.
Dans nos études, nous avons utilisé des inserts inférieurs avec des cellules stromales cultivées à 50% de confluence. Bien que la densité optimale des cellules du microenvironnement sur les inserts dépendra des objectifs de l'étude, ce qui peut être facilement manipulée et contrôlée.
Sélection d'un taux de contrainte de cisaillement
La contrainte de cisaillement de 0,8 dyn / cm 2 a été utilisé ici parce que cela a été démontré par Von Andrian et al. être la contrainte de cisaillement dans la microvasculatur de moelle osseusee, où les cellules progénitrices hématopoïétiques sortent de la circulation et les tissus pénètrent dans les conditions physiologiques normales 15. En revanche, les niveaux élevés de stress de cisaillement sont observés dans les grands navires, où extravasation des cellules est limité. Par conséquent, les taux de stress de cisaillement élevées pourraient être utilisés comme des contrôles supplémentaires pour les expériences examinant extravasation de divers types de cellules.
La survie des cellules sous la contrainte de cisaillement dépend de plusieurs facteurs, notamment le type de cellule et les traitements de cellules ex vivo (Gontcharova et al., Observations non publiées), et doit donc être soigneusement évalué au cours de l'essai. la sensibilité des cellules à différents niveaux de contrainte de cisaillement (résistance à la contrainte de cisaillement) peut être évaluée par la programmation de la pompe péristaltique à augmenter le taux de contrainte de cisaillement par incréments de 0,8 dyn / cm 2 à 6 dyn / cm 2. Lors de ces essais, les cellules peuvent être prélevés périodiquement à partir de la chambre d'échange de gaz pour surveiller la mort cellulaire en utilisant commedit comme exclusion du bleu trypan, annexine V et PI coloration, et l'expression de marqueurs de l'apoptose.
Si les expériences sont conçues pour tester la résistance de cisaillement des cellules modifiées ex vivo ou des cellules dérivées de parenchyme, il est recommandé que les contrôles positifs supplémentaires, telles que les cellules transmises par le sang, sont incluses dans les expériences.
Sélection de la taille des pores de la pièce rapportée et le revêtement ECM
Les inserts sont disponibles avec plusieurs tailles de pores (3, 5 et 8 pm). Le choix de la taille des pores va dépendre de la taille et les propriétés des cellules d'essai en circulation, ce qui est également le cas pour les essais statiques TRANSWELL. Inserts avec une taille de pores (8 pm) sont recommandés pour tester extravasation de grandes cellules comme les cellules tumorales d'origine épithéliale. Leucocytes ou de cellules souches hématopoïétiques sont plus souvent testés avec 5 inserts pores um et 3 inserts pores um Il vaut mieux réserver pour tester extravasation de scellules maller. Toutefois, la taille de la cellule d'essai seul n'est pas le seul facteur important et nous vous recommandons de tester inserts avec plusieurs tailles de pores.
Dans nos premières études, nous avons testé différents ECM pour leur capacité à soutenir la croissance de la CE sur les inserts et à résister au stress de cisaillement pour> 4 heures. L'ECM testés comprenaient Matrigel, poly-D-lysine, la fibronectine, la laminine, collagène de type I, hydrogel, Meta-kératine I, II, III, IV et extracellulaire. Les meilleurs résultats de croissance CE ont été obtenus avec extracellulaire, la fibronectine et le collagène. Cependant, dans nos mains, extracellulaire à 0,8 g / cm 2 réduit de manière significative la transmigration des cellules de test à travers la membrane. Par conséquent, nous utilisons maintenant la fibronectine (5 ug / cm 2) ou de collagène (5 ug / cm 2) pour le revêtement des inserts. Cependant, le choix optimal de l'ECM sera probablement influencée à la fois par le type de CE et les propriétés transmigratoires des cellules d'essai. Une expérience préliminaire doit être effectué pour tester la Integrité de la monocouche CE cultivé sur ECM sélectionné. Par exemple, placer des inserts pré-enduits monocouches avec la CE dans des boîtes de Pétri remplies de milieu de culture, placez les plats sur un agitateur pour créer la contrainte de cisaillement (valeur faible), et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 12 heures. L'intégrité de la CE après une exposition à la contrainte de cisaillement peut être évaluée en utilisant la coloration au cristal violet.
Sélection des concentrations cellulaires de test optimales
La capacité des cellules de test à la sortie de la circulation dépend de plusieurs caractéristiques propres à chaque type de cellule. Pour générer des résultats statistiquement significatifs, la densité cellulaire circulation doit être optimisé pour s'assurer qu'un nombre suffisant de cellules migrent dans les puits de contrôle positif. Par conséquent, nous vous recommandons d'effectuer les premiers tests avec une gamme de densités cellulaires (par exemple 10 3 / ml à 10 7 / ml) pour comprendre la relation entre le nombre de cellules chargées dans le système etle nombre de cellules qui subissent la transmigration.
En outre, la concentration de circulation optimal peut être différent pour le même type de cellules obtenues à partir de différentes sources. Par exemple, les cellules CD34 + sont une population hétérogène de cellules contenant à la fois des cellules souches hématopoïétiques et engagés progéniteurs lignée spécifiques. Ils peuvent être obtenus à partir de la moelle osseuse, sang périphérique mobilisé, et sang de cordon ombilical. Les cellules CD34 + provenant de ces trois sources possèdent des capacités différentes à tête chercheuse et la greffe 16-18, si les conditions de l'essai de ces cellules dans le dispositif 3D doivent être optimisés avant une étude à grande échelle.
Sélection des temps de circulation optimale des cellules
Le temps de circulation optimale doit être déterminée de façon empirique pour chaque type de cellule. Le temps minimum requis pour la circulation pourrait être extrapolé à partir des résultats des essais de migration statiques, mais cela peut être eXtended lorsque les cellules sont soumises à une contrainte de cisaillement. Des études pilotes d'essais des temps de circulation entre 4 et 96 heures est recommandée.
L'unité d'échange de gaz
Le but principal de l'unité d'échange de gaz est de maintenir la concentration optimale de CO 2 dans le milieu circulant à travers le dispositif 3D, similaire aux réglages dans les incubateurs de culture de tissus standards. L'unité d'échange de gaz peut également être utilisé pour l'ajout de cellules de test et de composés et pour la collecte des sondes et des échantillons au cours du test.
L'évaluation du nombre de cellules de test
Cellules circulantes peuvent être échantillonnés à différents moments au cours de l'expérience à travers l'unité d'échange de gaz. A la fin de l'expérience, les cellules restantes dans la circulation pourraient être collectées à partir de la sortie. Lorsque le dispositif 3D est démonté à la fin de l'expérience, les cellules transmigré peuvent être récoltées à partir des puits inférieurs et recueillies fou une analyse plus approfondie. Si les cellules d'entrée sont sans étiquette, les cellules transmigré peuvent être colorées au bleu trypan et des cellules vivantes / morts dénombrées au microscope. Alternativement, les cellules d'entrée peuvent être étiquetés avec l'un des nombreux "tracker" colorants cellulaires disponibles pour l'imagerie des cellules vivantes avant de les charger dans l'appareil 3D, dans ce cas, le récoltés transmigré cellules doivent être lysées pour la quantification de la fluorescence.
Sélection de la taille optimale de l'échantillon
Pour permettre une analyse statistique, un échantillon doit être sélectionné qui fournira environ 80% de puissance pour détecter la différence hypothétique dans les variations en pourcentage moyennes entre les deux groupes lors du test à un niveau de signification de 0,05 en utilisant un test t bilatéral. Basé sur notre expérience avec des cellules de la moelle osseuse, nous utilisons trois puits par condition expérimentale pour les expériences de périphériques 3D. Toutefois, la taille optimale de l'échantillon varie avec le but de l'expérience et doit être déterminé empirically. Plusieurs tests de régression statistique, recto verso t-tests et des analyses de variance peuvent être utilisés pour vérifier la pertinence statistique des résultats.
Sélection des chimiokines
Comme pour tous les tests de transmigration, le choix de chemoattractant sera dictée par les propriétés des cellules de test et l'objectif de l'étude. SDF-1 est un facteur chimiotactique bien établie pour les cellules hématopoïétiques. Dans nos mains, une concentration de 50 ng / ml SDF-1 était optimale pour stimuler l'extravasation des os des cellules progénitrices hématopoïétiques issues de la moelle. Nous utilisons aussi C3a et bFGF comme chemoattractants de cellules souches mésenchymateuses 19. Cependant, nous recommandons titrant chacun chimiokines et cross-titrage des combinaisons de chimiokines pour identifier la plage de concentration optimale avant une étude à grande échelle. Pour certains types de cellules, une combinaison de facteurs chimiotactiques peut être bénéfique. Si chimiokines pour les cellules d'essais spécifiques sont inconnus ou inaccessibles, conmédias ditioned de lymphocytes stimulés, les fibroblastes et d'autres cellules peuvent être utilisés comme une source de chemoattractants.
Sélection des paramètres lecture
La polyvalence de l'appareil 3D va étendre le type d'expériences de transmigration qui peuvent être effectuées, et le succès des expériences dépendra de réflexion approfondie et la conception des paramètres de lecture. En règle générale, les cellules recueillies à partir du compartiment supérieur (circulant) et le compartiment inférieur (statique) doivent être testés pour la viabilité en même temps que le comptage des cellules. Certaines cellules possèdent une faible tolérance à la contrainte de cisaillement physiologique observé dans le système microvasculaire. Dans ce cas, le nombre de cellules mortes sera augmentée dans le compartiment supérieur. Le nombre de cellules adhérentes arrêtés (ou piégés) sur la couche CE peut être évalué par immunohistochimie de marqueurs exprimés spécifiquement par les cellules de test. Des anticorps spécifiques pour CD31 et FvW peuvent être utiliséspour détecter les CE et pour permettre une discrimination entre les cellules de test et la CE. En outre, l'intégrité de la monocouche CE doit être surveillée à la fin de chaque test.
Les types d'analyses effectuées avec les cellules recueillies dépendra objectifs expérimentaux les enquêteurs, mais pourraient inclure des changements d'analyse de l'expression des gènes par microarrays et qPCR, l'expression des molécules de surface par analyse FACS, l'activation des voies de signalisation par FACS et Western blot, et le facteur sécrétion par ELISA. Un énorme éventail de tests fonctionnels sont possibles sur les cellules recueillies in vitro, comme en témoigne notre propre travail dans lequel nous cultivé les cellules de la moelle osseuse transmigré pour dénombrer les cellules progénitrices hématopoïétiques (Figure 3). Les échantillons recueillis pourraient également être testés dans une variété d'essais in vivo.
Un paramètre important qui peut aider à prédire le comportement des cellules d'essai in vivo est la tendancerence de certaines cellules à former des agrégats sous différents taux de cisaillement. Par exemple, les cellules thérapeutiques qui subissent la formation d'agrégats dans le dispositif 3D pourraient avoir une plus grande tendance à former des amas Après administration intraveineuse et causer une obstruction vasculaire aiguë in vivo (Gontcharova et al., Observations non publiées). Formation d'agrégats pourrait être surveillé au microscope par échantillonnage des cellules de test pendant ou après la fin de l'expérience de l'appareil 3D.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Chuck Scott et Victor McKnight de la CBS Scientific Company Inc. ( www.cbsscientific.com ) pour l'assistance technique et la fabrication de la chambre 3D, l'unité d'échange de gaz et inserts. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (subventions R21DK067084 et R43CA141782 à SKK).
Reagent/Material | |||
PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8) | Watson-Marlow Limitid | 981.0142.000 | |
3D Chamber | C.B.S.Scientific | FC-1000 | |
Gas exchange unit | C.B.S.Scientific | FCR-1000 | |
Inserts | C.B.S.Scientific | FCI-1005U | |
Collagen Bovine,Type I | BD Biosciences | 354231 | |
Hydrochloric Acid 0.1M | VWR | BDH3200-1 | |
PBS | Invitrogen | 14190 | |
HUVEC | Lonza | CC- 2517 | |
EGM Bullet Kit (cc – 3121 & cc – 4133) | Lonza | CC – 3124 | |
Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
HEPES | Lonza | CC-5024 | |
SDF-1 | R7D System | 460-SD | |
Extracel Trial 2.5 Kit | Glycosam Byosystems | GS211 | |
Fibronectin, human , nature | BD Biosciences | 356008 | |
Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
BD Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ScienCell | 1000 | |
Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells | ScienCell | 1001 | |
Trypan Blue | StemCells Tecnologies | 7050 | |
TNF-alfa, 10 μg | Invitrogen | PHC3015 | |
VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC | Southern Bioteck | 9519-02 | |
Propidium Iodide Staining Solutuion | BD Pharmingen | # 556463 | |
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | StemCell | CB007F | |
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells | Zenbio | SER – CD34-F | |
MethoCult GF M3434 | StemCells Tecnologies | GFM3434 | |
Mouse Methylcellulose complete media | R&D | HSC007 | |
Anti-Von Willibrand Factor antibody | abcam | C# ab11713 | |
Petry dish (35 x 10 mm) | VWR | CA25373-041 | |
15 ml tubes | VWR Fisher | 21008 – 918 | |
Tissue culture flasks 75cm2 | VWR | BD353136 | |
Cristal violet | Sigma | C-3886-25G | |
Dissecting forceps, curved | VWR | 82027-384 | |
1,000 μl Pipette tips | VWR | 83007-380 | |
1 – 200 μl Pipette tips | VWR | 37001-530 | |
Equipment | |||
Peristaltic pump | Watson-Marlow Limitid | 403U/VM3 |