La resistencia adquirida a los antibióticos es un problema importante de salud pública y está clasificado actualmente por la OMS como una de las mayores amenazas para la vida humana. Aquí se describe el uso de la tecnología de voladizo para cuantificar la resistencia antibacteriana, crítica para el descubrimiento de nuevos agentes y potente contra bacterias resistentes a múltiples fármacos.
El sensor en voladizo, que actúa como un transductor de reacciones entre el modelo de la pared bacteriana matriz de células inmovilizada en su superficie y fármacos antibióticos en solución, ha demostrado un potencial considerable en aplicaciones de detección bioquímicos con sensibilidad y especificidad 1-5 sin precedentes. Las interacciones fármaco-diana generan estrés superficie, haciendo que el voladizo se doble, y la señal se pueden analizar ópticamente cuando es iluminado por un láser. El cambio en la tensión superficial medida con precisión a escala nanométrica permite las interrupciones de la biomecánica del modelo de la pared celular bacteriana objetivos para ser rastreados en tiempo real. A pesar de ofrecer ventajas considerables, varios conjuntos de sensores cantilever nunca se han aplicado en la cuantificación de las interacciones de unión fármaco-diana.
Aquí, se presenta en el uso de silicio varias matrices voladizo revestida con alcanotiol monocapas auto-ensambladas que imitan la matriz de la pared celular bacteriana a los estu cuantitativamenteinteracciones de unión antibióticos dy. Para entender el impacto de la vancomicina en la mecánica de las estructuras de la pared celular bacteriana 1,6,7. Hemos desarrollado un nuevo modelo 1 que propone que la flexión en voladizo puede ser descrita por dos factores independientes; i) a saber, un factor químico, que está dada por una isoterma de adsorción de Langmuir clásica, de la que se calcula el equilibrio termodinámico constante de disociación (Kd) y ii) un factor geométrico, esencialmente una medida de cómo los receptores de péptidos bacterianos se distribuyen en la superficie en voladizo. La distribución de la superficie de receptores de péptidos (p) se utiliza para investigar la dependencia de la geometría y la carga de ligando. Se muestra que un valor de umbral de p ~ 10% es crítica para aplicaciones de detección. Por debajo del cual no hay señal detectable de flexión, mientras que por encima de este valor, la señal de flexión aumenta casi linealmente, revelando que el estrés es un producto de una unión química local FACtor y un factor geométrico combinado con la conectividad mecánica de las regiones han reaccionado y proporciona un nuevo paradigma para el diseño de agentes poderosos para combatir infecciones superbacteria.
El reconocimiento molecular paradigma sustenta grandes franjas de la biología y la medicina. En farmacología, por ejemplo, el objetivo es interferir con una vía patológica por dirigidas a un participante clave de un proceso bioquímico, tales como transglycoslyation o transpeptidación que cataliza la reticulación de los péptidos de la pared celular bacteriana. Por consiguiente, el diseño de fármacos se reduce a la definición de una molécula adecuada para dirigirse a un sitio específico de acoplamiento bacteriana para inducir un ajuste perfecto. Un ejemplo clásico emulando el éxito de este enfoque es la vancomicina (Van), que se dirige a la pared celular de peptidoglicano, una característica estructural conservada de una bacteria. En una naciente bacteria Gram-positiva, la matriz de peptidoglicano consiste en péptidos que terminan en la secuencia Lisina-D-alanina-D-alanina, atado a través de un enlazador 8-10 C55 lípidos aquí denominados D-Ala. Estos péptidos expuestos en los precursores de peptidoglicano son fundamentales para elprotección mecánica de las células bacterianas contra las fuerzas ambientales duras, y esto es importante, no se encuentra en las células humanas, lo que los objetivos ideales para fármacos antibióticos. Van se une específicamente al extremo C-terminal de los péptidos bacterianos de la pared celular que forman un moderadamente fuerte Van-péptido complejo como se muestra en la Figura 1. Esta interacción entre Van y los péptidos bloques expuestas las acciones de transpeptidases y transglycosylases, que catalizan la reticulación de las paredes de las células 1, detener efectivamente de reticulación y por lo tanto debilita nanomechanically la célula bacteriana que conduce a su muerte por ruptura 1,6, 7.
La aparición de Enterococcus resistente a la vancomicina (VRE) es un problema cada vez mayor atención sanitaria 11 y debido a la resistencia bacteriana en enterococos surge debido al cambio sutil de una amida linKage a un enlace éster 8, este cambio estructural aparentemente simple en la superficie de la bacteria elimina un solo enlace de hidrógeno a partir de Van 's sitio de acoplamiento con una modificación posterior del bolsillo de unión. Es importante destacar que este proceso altera el pentapéptido terminal de alanina presente en la vancomicina Enterococcus susceptibles (VSE) a una lisina-D-alanina-D-lactato 10,12, aquí denominado D-Lac, produciendo una reducción significativa en la afinidad de unión de Van-D-Lac por tres órdenes de magnitud prestación Van terapéuticamente eficaces contra las infecciones enterocócicas 1, el crecimiento alarmante de las bacterias resistentes a los antibióticos está conduciendo por lo tanto, el desarrollo de enfoques innovadores para acelerar y restaurar la actividad antibacteriana de los agentes antibacterianos o el descubrimiento de fármacos más potentes contra bacterias resistentes a múltiples fármacos infecciones.
<pclass = "jove_content"> Nuestros experimentos con voladizos exentas se inspira en los sistemas tales como las células que aprovechen la energía química en marcha. La capacidad de los sensores de cantilever para traducir la energía química en movimiento mecánico ellos sondas únicas con ventajas considerables para el seguimiento de las perturbaciones mecánicas de los objetivos de la pared celular bacteriana en tiempo real hace. Los sensores de cantilever requieren 'etiquetas' no reportero y biomoléculas se detectan rápidamente en una reacción de un solo paso. Ellos pueden detectar múltiples fármacos en paralelo en ambientes fisiológicos tales como soluciones tampón y suero entero. Además, la tecnología de voladizo utiliza en el referenciado in situ para mediciones diferenciales que les permite detectar específicamente las interacciones fármaco-diana y, en virtud de su fabricación a través de las rutas de procesamiento de semiconductores estándar, que son susceptibles para la producción en masa y paralelización de cribado de alto rendimiento de miles de fármacos por hora. En partilares múltiples matrices de sensores en voladizo son herramientas útiles para el estudio de resistencia a los antibióticos a la vancomicina – porque la resistencia a la vancomicina es esencialmente un problema mecánico 1,6,7. Las reacciones entre un blanco modelo de pared de célula bacteriana y Van en solución pueden ser detectados mediante la supervisión de los cambios en la tensión inducida clínicamente relevante de interacciones de unión fármaco-diana. La tensión generada a partir de reacciones en la superficie que se manifiesta en una señal de flexión en voladizo se analiza ópticamente por los sensores de iluminación con un haz de láser. Además mediante la adaptación de la capa receptiva de bacterias moléculas diana de superficie en la parte superior del sensor en voladizo, cerca de un número ilimitado de analitos (Van), las interacciones bioquímicas específicas y la biomecánica del modelo de matriz de la pared celular bacteriana se controla en tiempo real. Aparte del evento de reconocimiento molecular, hay varios factores que pueden causar sensores de cantilever para deflect, que incluyen – las variaciones de temperatura, de unión no específica o cambios de índice de refracción de la solución. Para tener en cuenta para las señales no específicas, jp las mediciones diferenciales in situ se realizan donde la curvatura de tanto la medición y voladizos de referencia se controlan continuamente para analizar las interacciones específicas. Por otra parte, la sensibilidad de detección de los sensores de cantilever que dependen de la química de la superficie y la geometría se pueden mejorar mediante el ajuste de la superficie de la densidad p (donde p se define como la proporción de la superficie ocupada por las moléculas de captura para toda el área de la superficie superior del voladizo cubierto por la población total de moléculas tal como se determina por espectroscopia de rayos X de fotoelectrones (XPS) 1.Aquí este protocolo detalles cómo vancomicina o cualquier otro antibiótico vinculante a los teléfonos análogos de precursores de la pared bacteriana (mucopeptides) a concentraciones clínicamente relevantes en una solución tampónND suero de la sangre puede ser detectado mediante el uso de la tecnología de etiqueta libre de voladizo. Superficies de oro frescas se utilizan porque monocapas auto-ensambladas (SAMs) tienden a formar fácilmente capas estables en el oro limpio 13,14. MCS se compone de moléculas cortas con un resto tiol unido covalentemente a la superficie de oro, mientras que se permite que la unidad de captura deseado en el otro extremo para interactuar libremente con los objetivos de analito en la solución. Los tioles forman un sistema flexible, en particular dado que muchos compuestos de tiol con diferentes grupos terminales químicos están disponibles comercialmente o se sintetizan fácilmente en un laboratorio. Sin embargo, se debe tener cuidado para asegurar que las moléculas con un resto tiol deben tener los grupos terminales correctos, por ejemplo, en una proteína o péptido de la conjugación, el grupo amino debe enfrentarse hacia el interior para la reacción con el grupo carboxílico del resto tiol atado en la la superficie que se produzca. Aquí, los tioles son directamente conjugado con miméticos tripéptido de lípidos bacteriana II de la bpared celular acterial objetivos sintetizado por metodología de fase sólida utilizando comercialmente disponible precargado Wang-D-Ala y resinas Wang-D-Lac y el estándar grupo protector de Fmoc química 15. Aunque esta descripción se enfoca a la vancomicina, es evidente que se puede extender a otros antibióticos y de hecho más estudios son invitados por investigadores de diferentes campos en particular en la bioquímica, la farmacología y la ciencia de los materiales para adoptar fácilmente este protocolo para sus propios experimentos.
Estos resultados demuestran que los sensores de la batería en voladizo tienen la sensibilidad para detectar y cuantificar los cambios en las interacciones de unión fármaco-diana especialmente en resistencia a la vancomicina asociada con la supresión de un único enlace de H del bolsillo de unión del fármaco. Se demuestra una sensibilidad de detección nanomolar de Van de acuerdo con la resonancia de plasmones (SPR) estudios superficiales anteriores 18,19, y ponen de manifiesto que el método voladizo puede detectar directamente y cuantificar moléculas de la droga en la sangre en concentraciones clínicamente relevantes que se aplican rutinariamente en la práctica clínica. Nuestros datos sugieren que la tensión superficial diferencial puede ser descrita por una ecuación de la forma del producto (1), es decir, (i) un término químico que describe los eventos de unión fármaco-diana específicas, y (ii) un plazo geométrica que describe la conectividad mecánica entre hace reaccionar químicamente sitios de la superficie, lo que implica que las interacciones químicas locales desacoplan del mecánico mundialal interacciones del cantilever. Mientras que el término química viene dada por la isoterma de adsorción de Langmuir clásica, el término geométrica revela un mecanismo de percolación de las inducidas por drogas-diana cambios de la tensión de superficie. El PC umbral crítico ~ 10% (Figura 5) era necesario para detectar el diferencial de flexión en voladizo, que muestra que la tensión superficial se transduce colectivamente cuando una fracción de superficie relativamente grande está ocupado por moléculas de antibióticos. Para p ≥ PC, la conexión mecánica entre los sitios de la superficie transformadas químicamente se establece gradualmente, y las interacciones de repulsión de corto alcance tales como las interacciones estéricas entre los nodos de la red nanomecánica da lugar a una mayor flexión hacia abajo de todo el voladizo. Se especula que nuestro modelo de percolación nanomecánica puede jugar un papel importante en el modo de antibiótico glicopéptido de la acción de las bacterias reales. Estos resultados ponen de manifiesto la alta sensibilidad de la tecnología cantilever para studying modo de acción antibióticos "y representar una nueva herramienta de investigación para el estudio de fármacos para mejorar la comprensión de las operaciones de los antibióticos en la nano escala para informar y permitir el descubrimiento de drogas de gran alcance para el control de los problemas de infecciones superbacteria. Para preparar el sistema cantilever para mediciones reproducibles y sensibles, hemos abordado una serie de objetivos en el protocolo, en especial para la carga de la muestra en la celda de microfluidos y procedimientos normalizados de trabajo para permitir detecciones nanomecánicos cuantitativos.
Importancia de la tecnología en voladizo con respecto a los métodos existentes
En resumen podemos destacar que, si bien esta tecnología se propuso hace más de 25 años, no ha encontrado su camino en la clínica debido a la falta de medidas cuidadosas y repetitivo sobre médicamente objetivos pertinentes. Aquí se demuestra los procedimientos que establecen la importancia de la utilización de voladizos nanomecánicos para investigar el mecánicoAl influencia de los antibióticos en los objetivos de la pared celular bacteriana y para detectar resistencia a los antibacterianos. Los métodos convencionales de selección de fármacos requieren algún tipo de etiquetado fluorescente o radiactiva de una molécula informadora para medir la unión de un analito a su objetivo, a menudo en relación con un ensayo de unión competitiva o ensayos de proteína enzimática y 20. El marcaje de biomoléculas es no sólo requiere mucho tiempo y caro, pero la etiqueta también puede interferir con la interacción molecular por obstruir el sitio de unión, dando lugar a falsos negativos. Además, los compuestos fluorescentes son a menudo hidrófobo que puede conducir a la unión de fondo y falsos positivos. Debido a estas limitaciones, existe un creciente interés en nuevas técnicas libres de etiquetas que permiten que prácticamente cualquier complejo molecular que se rastreó con un desarrollo mínimo ensayo. Las tecnologías de la superficie de la etiqueta sin más reconocidos en la actualidad son SPR y el cristal de cuarzo microbalanza (QCM). En contraste con SPR que medida ªe constante dieléctrica, una etiqueta – la tecnología de voladizo libre detecta la cepa superficie generada por una interacción ligando-receptor, que puede medir directamente las fuerzas nanomecánicos generados por la unión específica de ligandos a receptores de la superficie. La singularidad de estos sensores es que su sensibilidad no se basa en propiedades dieléctricas causados por el cambio de masa debido a la unión como en el SPR y QCM sino más bien en un cambio inducido por el estrés más mínimo en la superficie en el plano analito, haciendo que la tecnología especialmente adecuado para estudiar los nanomecánica de moléculas de fármacos a concentraciones de antibióticos clínicamente relevantes (3.27 M) 17. Voladizos también están particularmente bien adaptados a molécula pequeña (por ejemplo, fragmentos de ADN y fármacos) de detección en condiciones fisiológicas incluyendo entornos complejos que es en gran parte la base de la industria farmacéutica y por lo tanto, servir como una herramienta complementaria en el descubrimiento de fármacos. Tecnología Cantilever éxito se han aplicado en elcampos de la genómica 3,5, sensores de gas 21, proteómica 22, y las drogas 1. Por otra parte, los voladizos están fabricados utilizando tecnología de silicio de bajo coste y debido a su compatibilidad con los procesos de microfabricación, voladizos pueden ser miniaturizados para la mejora de la sensibilidad y paralelización en grandes series de sensores para la detección del compuesto a múltiples fármacos y ensayos de cribado ricas en información de mayor rendimiento. Las mejoras de la instrumentación y el diseño experimental permitirá una amplia variedad de interacciones que se analizan en tiempo real para ayudar a avanzar en la búsqueda de una nueva generación de Superdrugs para abordar los problemas de las infecciones resistentes a múltiples fármacos.
Los pasos críticos en el protocolo
El desarrollo de protocolos de medición robustos es fundamental para las aplicaciones de esta tecnología. Para lograr mediciones fármaco-diana cuantitativos satisfactorios y para determinar la concentración más baja de antibióticos tsombrero puede ser detectado en el tampón de la sangre o suero, se trataron los pasos críticos en el protocolo. La primera tarea implica el ajuste y la optimización química de la superficie de captura para mejorar la especificidad y la sensibilidad de detección en voladizo. Sin lugar a dudas, la transducción de la tensión superficial es un fenómeno colectivo, que requiere una fracción relativamente grande de la superficie a cubrir para establecer la conectividad entre las regiones químicamente reactivos. Se demuestra que mediante la variación de la densidad de los péptidos de la superficie subyacente, un umbral crítico ~ p ≥ 10%, donde se determina la escala de la tensión superficial en función de la densidad de péptido y cero en otro caso (figura 5). Es importante que los experimentos están diseñados para investigar la uniformidad de la tensión a lo largo de los voladizos para asegurar flechas máximas de señal para mediciones sensibles. Además, los protocolos de regeneración de superficie eficientes deben estar en su lugar, permitiendo de este modo múltiples mediciones de ciclo y reducir los costes para cada uno TESt. Si bien el diseño de un receptor de la superficie usando extremo hidrófobo tiolado, la orientación de la molécula del receptor y el espaciamiento entre ellos es vital para permitir auto-ensamblaje de empaquetamiento denso debido a las interacciones de Van-der-Waals entre las moléculas de minimizar las interacciones no específicas. Además, las moléculas de captura deben contener un polietilenglicol (PEG) enlazador para permitir una cierta parte de la matriz de detección para que sea hidrófila para evitar la inserción de moléculas de analito en la solución de reacción directamente con la superficie de oro sin revestir. Las moléculas de enlace PEG deben actuar como espaciadores para reducir los impedimentos estéricos y por lo tanto permiten que los analitos solución específicamente para interactuar con los receptores de la superficie para inducir el cambio tensión superficial medible. El sensor de serie de voladizo debe ensayarse con al menos una medición de referencia en situ y la señal mostrada en tiempo real, es una desviación diferencial, obtiene restando la desviación absoluta de la voladizo de referencia de la sENSING voladizos. Así, un voladizo de referencia es esencial para la función de las interacciones no específicas, tales como los cambios de temperatura, cambios en el índice de refracción o interacciones no funcionalizado en la parte inferior del voladizo. Optimización de la velocidad de flujo (~ 30-150 l / min) forma un paso crítico en el protocolo, ya que garantiza el intercambio eficiente de los líquidos y un transporte de masa constante suficiente de materiales de solución. El diseño de una celda de líquido debe permitir volumen óptimo (5-80 l) para las tasas de flujo rápido para permitir el intercambio líquido perfecta para superar las limitaciones de transporte de masa. La velocidad de flujo es especialmente crítico, mientras que la realización de mediciones cinéticas 23. Cámaras de líquido de gran volumen requieren tasas altas de flujo incontrolables que conducen a grandes requerimientos de volumen de muestra, que aumenta innecesariamente el precio del ensayo. Anteriormente hemos utilizado el flujo por gravedad para inyectar diferentes muestras de líquido en la cámara de medición. El flujo por gravedad tiene la ventaja de que DOEs no requieren ninguna pieza mecánica y por lo tanto no introduce ruido adicional en el sistema. Sin embargo, su desventaja significativa es que sólo funciona de forma fiable a tasas relativamente altas de flujo (~ 200 l / min). Obviamente, una velocidad de flujo inferior (≤ 1 l / min) requeriría volúmenes de muestra limitados por unidad de tiempo, pero por otro lado, hace que las reacciones mucho más lento y por lo tanto requiere tiempos de contacto más largo. Por otra parte, el flujo por gravedad tiene una gran variación en su velocidad de flujo ya que depende de la diferencia de altura entre la entrada y la salida, lo que disminuye a medida que las soluciones de muestra se consumen durante el experimento. Para evitar problemas de flujo por gravedad, se debe utilizar una bomba de jeringa. La ventaja de utilizar una bomba de jeringa es que permite una velocidad de flujo constante durante un largo período de tiempo permitiendo que los experimentos que se realizan en un ambiente más controlado.
Limitaciones del protocolo
El mayor desafío en la obtención de un reproducible unadetección biológica específica d el uso de sensores de cantilever reside en asegurar que las propiedades de la capa de receptor son bioquímicamente "activa" y uniforme para todos y cada ensayo. El secreto para el éxito experimental es en un cuidadoso tratamiento previo del chip sensor con una limpieza normalizada y el protocolo de inmovilización con químicas de enlazador para orientar las moléculas receptoras en su conformación activa. En nuestra configuración actual, funcionalizar matrices cantilever con pequeños capilares de vidrio, lo que podría estar sujeto a algunos inconvenientes y puede ser un problema en algunos casos. Estos capilares de vidrio están abiertos en ambos extremos y por lo tanto los disolventes de muestra se puede evaporar fácilmente. Por ejemplo, si la temperatura de la etapa de funcionalización no se controla con precisión, la velocidad de evaporación puede variar significativamente en diferentes momentos particularmente cuando se usan disolventes volátiles, como el etanol. También hay una posibilidad de una ligera variación en el tiempo de incubación de uno a otro en voladizo gada que los líquidos de detección tienen que ser cargados consecutivamente en los capilares. El otro factor limitante en la funcionalización capilar es la falta de la capacidad de asegurar que voladizos siempre se insertan en los capilares exactamente de la misma manera. Además, a veces los voladizos tienen que ser sacado un poco de los capilares con el fin de evitar la contaminación cruzada como las muestras líquidas pueden fluir en el cuerpo del chip. Podemos resolver estos problemas mediante el empleo de observadores de inyección de tinta como un procedimiento de recubrimiento superficial alternativa a voladizos capa. Si bien sería permitir que el control exacto de recubrimiento de la muestra con la posibilidad de ampliación de escala para grandes matrices, el inconveniente más común es que las pequeñas gotas que se depositan sobre los voladizos pueden evaporarse en cuestión de segundos y requiere un ambiente de humedad controlada. Por lo tanto, el tiempo de incubación no se puede ajustar fácilmente, lo que podría ser deseable para algunas aplicaciones. La sutil interacción de los factores, como muestra de volume, tiempo de incubación y la tasa de evaporación tienen un impacto directo sobre la exposición de los voladizos de la muestra funcionalización y se debe tener cuidado para asegurar químicas superficiales optimizado para los ensayos en voladizo que cualquier pequeña variación en la densidad molecular receptor tendrá un gran efecto en el voladizo respuesta.
Modificaciones de diseño experimentales (es decir, técnicas o materiales alternativos)
Para superar el reto principal en la obtención de procedimiento de recubrimiento reproducible para el desarrollo futuro de la tecnología en voladizo, se requieren diferentes estrategias que usaría voladizos integrados en los canales de microfluidos. La idea es que los chips especiales en voladizo se diseñarán de manera que cada voladizo se coloca en su propio canal para permitir la línea jp los procedimientos de funcionalización situ donde se abordaron los canales individualmente. Estas modificaciones de diseño experimentales permitirían proceso de recubrimiento que se realiceed en un entorno controlado y cerrado en el que la exposición al disolvente se controla precisamente por el tiempo de incubación y la velocidad de flujo automatizado para la inmovilización de moléculas de captura en los chips en voladizo. Los mismos canales podrían ser utilizados para los experimentos de unión real en todos los voladizos podrían estar expuestos a la misma solución de analito. Además del procedimiento de funcionalización en voladizo, el mecanismo de lectura cantilever también tendría que mejorar. El método de deflexión de haz óptico es muy sensible y se ha utilizado con éxito en la tecnología de Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) durante muchos años. Sin embargo, para las aplicaciones de sensores en voladizo de pie libre la lectura óptico tiene algunos inconvenientes, por ejemplo, que no permite mediciones en líquidos opacos tales como la sangre, la alineación de un conjunto de láseres que puede ser lento y tedioso y la configuración actual no puede diferenciar entre las desviaciones de inclinación y vertical. Así, el desarrollo futuro de la cantilevtecnología er tendrá que considerar los aspectos del diseño del sensor general (por ejemplo, las geometrías voladizo) y la lectura del voladizo para los protocolos de medición de sólidos, tanto en los ámbitos y entornos de laboratorio. Manalis y compañeros de trabajo 22 se han desarrollado nuevos tipos de sensores de cantilever huecos donde los voladizos tienen un canal de microfluidos incrustado dentro de la viga, permitiendo que el dispositivo puede operar en un vacío con factores de alta calidad. En este modo, actúan como microbalanza de voladizos 22, y por lo tanto ya no es necesario tener una asimetría entre los dos lados con respecto a la funcionalización, por lo tanto las moléculas de captura pueden ser adsorbidas o unidas de forma covalente directamente sobre el silicio, típicamente usando SAM o silanos 24. Las ménsulas también se pueden modificar con una capa delgada de polímero que es entonces conjugado con anticuerpos 25 para la detección bioquímicos.
Solución de problemas
Un profesional comúnblema asociado con las mediciones en voladizo es la introducción de burbujas de aire en la celda de flujo de microfluidos. Se debe tener cuidado para asegurarse de que no hay burbujas de aire se introducen en la célula líquido mientras se monta el chip. Señal de la deriva es también otro problema común causado por las diferencias en la temperatura de las muestras. Los voladizos ha de ser equilibrada para estabilizar antes de realizar las mediciones. Todos los tampones, analitos y soluciones de regeneración deben ser almacenados en la misma habitación que el instrumento voladizo para permitir que todas las soluciones tengan la misma temperatura. Aunque la bomba de jeringa puede proporcionar velocidades de flujo muy precisos y extremadamente baja, por lo general se asocia con el ruido mecánico en las mediciones en voladizo. Por lo tanto, es importante diseñar un simple y eficaz reductor de ruido para evitar el ruido innecesario en las señales de deflexión. El reductor de ruido consta de pequeño depósito de líquido situada entre la bomba de jeringa y la celda de líquido, que absorbe tque el ruido mecánico de la bomba. Debido a la naturaleza sensible de detector óptico, el sistema de medición en voladizo idealmente se debe utilizar en una instalación cerrada para bloquear las luces parásitas de interferir con el sistema de lectura óptica. Además, la calidad de las capas de detección puede disminuir significativamente si un gran número de etapas de lavado se llevan a cabo en los voladizos que limitan la vida útil del chip sensor.
Aplicaciones alternativas o futuros después de dominar esta técnica
Voladizos recubiertas con SAM que terminan en un grupo amino-o carboxilo-grupo pueden ser utilizados como sensores de pH. Los grupos terminales funcionales protonar o desprotonar dependiendo del pH de la solución y pueden generar una carga superficial que lleva el voladizo de doblar 24. Dado que los sensores de cantilever pueden rastrear las interacciones fármaco-diana asociados a la desestabilización de la pared celular de las bacterias de vida 1,6,7, serán por lo tanto, ayudar ala búsqueda y para el desarrollo de una nueva generación de antibióticos para combatir las infecciones resistentes a los fármacos. En futuras voladizos sería utilizado como microbalanzas para medir la masa y las tasas de crecimiento de las células individuales 26. La tecnología de voladizo será beneficioso para el estudio de las respuestas celulares a diferentes factores de crecimiento o medicamentos. También ofrecerá una nueva herramienta para la detección rápida de múltiples biomarcadores, que tiene relevancia inmediata en aplicaciones médicas y de punto de cuidado. Teniendo en cuenta la versatilidad, pequeño tamaño, y la robustez de sensores de cantilever, formarán un monitor sensible de factores ambientales nocivos. Ellos han demostrado ya su sensibilidad en la detección de gases tóxicos y nocivos que pueden escapar de la unidades de producción industrial y de laboratorio en el medio ambiente, tales como el ácido fluorhídrico 27 o cianuro de hidrógeno 28.
The authors have nothing to disclose.
Joseph W. Ndieyira fue apoyada por el Consejo de Ingeniería y Ciencias Físicas de Investigación (EPRSC), el Centro Interdisciplinario de Investigación en Nanotecnología (IRC), la Royal Society (RS) y consultoría Biano (BNC). Agradecemos, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment y Gabriel Aeppli útil para los debates.
Items | Catalog Number | Company | コメント |
Scentris | Scentris, Veeco Instruments, Inc | Not in production | |
Six-way valve | MVP, Hamilton, Reno, NV | Enables multiple concentration injection | |
EB Evaporator | BOC Edwards Auto 500, UK | Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems | |
Storage vessel | Agar Scientific, UK | Keeps gold coated films fresh | |
Glass capillary | King Precision Glass, Claremont, CA, USA | For capillary functionalization of the cantilever arrays | |
Pump | Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA | Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels | |
0.2-4.5 μm Filters | 1511940001 | Merck Millipore | For sample filtering |
Cantilever chips | London Centre for Nanotechnology (LCN) | Highly sensitive | |
Sodium phosphate monobasic | 10049-21-5 | Sigma-Aldrich, UK | For making buffer solutions |
Sodium phosphate dibasic | 7558-79-4 | Sigma-Aldrich, UK | For making buffer solutions |
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80 | 9005-65-6 | Sigma-Aldrich, UK | Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware |
DI water | Millipore Co., Billerica, MA, USA | Used for making solutions | |
Whole serum | GEM-700-110-H | Sera Laboratories International Ltd, UK | Used in measurements that mimic physiological conditions |
Vancomycin (Van) | 1404-93-9 | Sigma-Aldrich, UK | Drug used |
Sulfuric acid | 7664-93-9 | Sigma-Aldrich, UK | Used for glassware cleaning procedures |
Hydrogen peroxide | 7722-84-1 | Sigma-Aldrich, UK | Used for glassware cleaning procedures |
D-Ala and D-Lac | London Centre for Nanotechnology (LCN) | Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions | |
LabView | National Instruments Co., Austin, TX, USA | Software used for instrumental interface to allow controlled measurements | |