אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.
דגי ה-DNA 3D הפך לכלי עיקרי לניתוח ארגון תלת ממדי של הגרעין, וכמה וריאציות של הטכניקה שפורסמו. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול אשר עברו אופטימיזציה עבור חוסן, שחזור, וקלויות שימוש. מאור בדיקות ישירות כותרת ניאון מופקות על ידי ניק-תרגום עם אמינו-allyldUTP אחרי הצימוד כימי של הצבע. דגי ה-DNA 3D מתבצע באמצעות צעד הקפאת הפשרה לpermeabilization התא וצעד לחימום denaturation סימולטני של בדיקה ה-DNA והגרעינית. הפרוטוקול הוא ישים למגוון של סוגי תאים ומגוון רחב של בדיקות (BACS, פלסמידים, fosmids, או צבעי כרומוזום שלמים) ומאפשר הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה. בשיטה זו אנו שיגרתי לחקור לוקליזציה גרעינית של עד שלושה אזורים בכרומוזומים.
ה-DNA הקרינה הכלאה באתר (FISH-DNA) מאפשרת הדמיה תלת ממדית של לוקוסים בודדים גן, תחומים subchromosomal וכרומוזומים אפילו כולו בכל שלבי מחזור החיים של התא. דגי 2D משמש למחקרי metaphase בעוד דגי 3D כבר נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את הקשר בין הארגון המרחבי של הגנום ותפקודו במהלך שלבי ביניים (1,2 והפניות בו). מבחינה היסטורית, מחקרי שיתוף עמותה בוצעו על ידי חקירת עשרות עד מאות בודדים לוקוסים על ידי דגים. טכניקות רב עוצמה גבוהות יותר לאחרונה תפוקה מבוססת 3C כגון 4C וHi-C פותחו 3, המאפשרות חקירה צולבת דיבורים מולקולריים בין אלפים רבים של לוקוסים שונים. בעוד טכניקות מבוססות 3C ודגי DNA יכולים להיות שיטות משלימות, הם לא בהכרח לענות על אותן השאלות. שיטות מבוססות 3C לספק readout הרכב של אוכלוסיות תאים מעורבות, וכתוצאה מכך probability לעמיתים לעמותות. בניגוד לכך, בעוד בתפוקה נמוכה, המבוססות על טכניקות דגים מציעות את האפשרות לנתח סידורים מרחביים של לוקוסים או כרומוזומים בתאים בודדים על פי שלבי המחזור התפתחותיים או סלולריים שלהם. לפיכך, דגים ימשיכו להיות כלי חשוב לחיטוט יחסי פונקצית מבנה גרעיניים.
ישנם שני שיקולים עיקריים בביצוע ניסויי דגים 3D מוצלחים. אלה הם: 1. קבלת בדיקות שכותרתו בצורה אופטימלית ו -2. בחירה של טיפולים סלולריים, כולל קיבעון, לפני וצעדים שלאחר הכלאה, כדי לשמור על מורפולוגיה גרעינית עד כמה שניתן בעת ביצוע ה-DNA נגישה מספיק להכלאת חללית. תיוג בדיקה יעיל חשוב מאוד לדגים. באופן מסורתי, ניק-תרגום נעשה שימוש כדי להציג או hapten או נוקלאוטידים fluorophore-מצומדות 4. בדומה לכך, ערכות ניק-תרגום המסחרי זמינות עבור hapten הישיר או התאגדות fluorophore, buלא גם לתיוג שני שלבי שימוש בנוקלאוטידים aminoallyl וצבעים אמין-תגובתי. זה האחרון הופך את שילוב צבע יעיל יותר על ידי מתן פולימראז ה-DNA מולקולה פחות מגושמת לעבוד איתו. לאחרונה, ערכות לתיוג הלא האנזימטית של ה-DNA פותחו אשר מחייבים לנצל קואורדינטיבית של פלטינה לחומצות גרעין. אפילו ניתן לרכוש כבר 5 בדיקות שכותרתו דגים. בעוד ערכות ובדיקות שיוצרו באופן מסחרי ללא ספק נותנים נוחות שימוש, הם הרבה יותר יקרים מאשר לקנות רכיבים הבודדים ובייצור בדיקות בבית. אנחנו מותאמים פרוטוקול תרגום ניק עלות נמוך כדי לתייג ישירות רבות בדיקות שונות BAC במספר צבעים. גילתה שקבלת דנ"א BAC הטהור ביותר היא קריטית ותוצאות בדרישה רק 10-20 ng של חללית לכל שקופית דגים, בהשוואה ל 10 – 20 של פי יותר כאשר ה-DNA משמש תבנית טמאה, וכתוצאה מכך העלות גדולה וזמן חיסכון. השימוש באמין allyldUTP מאפשר תיוג גמיש שלבדיקות עם צבעים אמין-reactive זמינים (למשל אלקסה פלואוריד או CY-צבעים) או haptens (למשל ביוטין, digoxigenin). בדיקות hapten שכותרתו מזוהות על ידי נוגדני fluorophore-מצומדות או streptavidin להגביר ולדמיין את האות. בדיקות ישירות כותרתו בהירה בדרך כלל מראות פחות מכתים רקע ולהימנע יתר הגברה של אותות, ולכן כתוצאה מייצוג מדויק יותר של לוקליזציה גרעינית ומורפולוגיה לוקוס.
קיימות מספר טכניקות דגים שונים שמשתמשות בfixatives שונה, טיפולים מראש, ושטיפות לאחר הכלאה אבל אלה בדרך כלל נופלים לתוך הקטגוריות הבאות: קיבעון glutaraldehyde עם NaOH denaturation, קיבעון פורמלדהיד עם HCl denaturation, וקיבעון פורמלדהיד עם denaturation חום 6-9 . לכל אלה יש יתרונות וחסרונות. תוצאות glutaraldehyde קיבעון בשימור מבני גרעין טוב, אבל דורש טיפול עם צמצום סוכנים כדי למזערautofluorescence כתוצאה מכך, וטיפול NaOH צריך להיות מבוקרים בקפידה כדי לאזן denaturation DNA מספיק ונזק אפשרי למבנה גרעיני 6. קיבעון פורמלדהיד הוא פחות חזק, נותן סבירות מוגברת של הפרעות של אדריכלות גרעינית, אלא גם נותן בדרך כלל אותות ונמוכים autofluorescence 9 חזקים יותר ואמינים יותר. HCl טיפול depurinates DNA ורצועות את החלבונים, ומספק גישה טובה ל-DNA לבדיקות, אלא גם עשוי להציג את הפסקות DNA. חימום פיזי שמפריד בין שני גדילי דנ"א וכתוצאה מהכלאת המטרה טובה ואותות חזקים, אבל יכול לגרום להפרעות במבנה גרעיני 8. המידה שבה כל אחת מטכניקות אלה משפיע epitopes החלבון משתנית מאוד 6,9, וכתוצאה מכך הדרישה לקבוע באופן ניסיוני עבור כל חלבון הפרוטוקול האופטימלי לשימוש בניסויים חיסוני דגים.
אמנם אין DNA FISH te "מושלם"chnique, כולם יכול להיות שימושי אם גם בשליטה. המטרה שלנו הייתה לעשות אופטימיזציה של פרוטוקול ה-DNA לדגים חזקים ולשעתק לחקור מיקום המרחבי של לוקוסים רבים במגוון רחב של סוגי תאים 10, תוך התמקדות בשיטת החימום עבור רוב האותות אמינים. עם זה ושימוש במערכת הדמיה האוטומטית נועדו להגדיל את התפוקה לניתוח תא בודד של הסדרים גרעיניים.
דגי ה-DNA 3D הפך לכלי להכרה רחבה לנתח סידורים מרחביים בגרעין. בעוד דגים מספק תוצאות חזותיות וישירה, כמו בכל טכניקה, צריך להיות מודעים למגבלותיו. דגי ה-DNA בפני הבעיה המהותית שטיפולים קשים יחסית יש צורך להפוך את הכרומטין נגיש לבדיקות דגים שסופו של דבר משבשים את מבנה הדבר מאוד הגרעיני שהוא להיות מנותחים. כמה אסטרטגיות כבר רדף ללהטט נגישות ושימור מבנה. בפרוטוקול המתואר כאן, ה-DNA הכרומוזומלי נעשתה נגיש על ידי permeabilization הקפאת הפשרה של תאים וDenaturation חום לפני ההכלאה חללית. Solovei, et al., (2002) ניתחו שינויים מבניים לאחר טיפול דומה ומצא כי התזוזה הממוצעת של תחומים הכרומטין הייתה 300 ננומטר אשר מגביל את הרזולוציה של ניתוח מבני לאזורים בערך 1 MB בגנום 8. אמנם זה לא ברזולוציה גבוהה, זההוא בקנה מידה סבירה לניתוח עמדה גרעינית.
שיקול מעשי יותר לניתוח דג הוא שרכישת תמונה ומדידות של מרחקים גרעיניים הן תהליכי זמן רב המגבילים את מספר הגרעינים שניתן לנתח. על מנת ללמוד אירועים נדירים שמטרתם לעשות הדמיה אוטומטית קצב העברת נתונים גבוהה. ואז, עם בקרות מתאימות במקום, ניתן להשוות בכמות מספקת כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי חזק של יחסים מרחביים. אנו שגרתי לנתח 600 גרעינים לכל נקודת נתונים שעבורו אנו קובעים את קואורדינטות 3D של כל אותות הדגים בתוך הנפח הגרעיני. נתונים אלה דורשים שטח אחסון קטן מאוד ומאפשרים ניתוח של מרחקים בין משפחות ותוך allelic, או עמדות רדיאליים בכל שלב מאוחר יותר. יתר על כן, אפשר לעשות עיבוד אוטומטי באופן עיוור חוקר אשר מקטין באופן משמעותי את הסבירות להטיה לא מודעת.
כדי לאפשר לanalys תפוקה גבוהה מסוג זההוא, המטרה שלנו הייתה להקים בדרך מהירה ויעילה של ביצוע דגי ה-DNA. מצאנו הפרוטוקול מתואר כאן להיות מאוד חזק, באופן עקבי לייצר אותות בהירים עם רקע נמוך. זה עבד לכל סוגי התאים שניסינו סיפק לנו להתאים את הצעד של הצמדת התאים לשקופית. יתר על כן, עם חריג אחד, כולנו משמשים Bács יכול להפוך לבדיקות בהירות. יש לנו גם זוהו בהצלחה מספר החלבונים גרעיניים על ידי מכתים נוגדן לאחר דגי ה-DNA. בעוד עבור חלבונים מסוימים זה עובד טוב, אנו ממליצים השוואה עם immunofluorescence המסורתי (IF) על מנת להבטיח עקביות של דפוס מכתים הנוגדן בין אם ודגים חיסוני דנ"א (השווה 11).
באופן כללי, מצאנו כי בדיקות שכותרת בצבעים שונים הפיקו את אותן תוצאות. עם זאת, יש לשקול את ההיבטים הבאים בעת בחירת צבע הסימון. ראשית, הצבע של fluorophore צריך להיות גם לזיהוי על ידי u מיקרוסקופSED. שנית, אורך הגל של האור הנפלט על ידי fluorophores צריך להיות שונה במידה מספקת, כדי למנוע דימום דרך לערוץ האחר. זה יהיה תלוי במסננים במיקרוסקופ. והשלישי, לפחות בידיים שלנו, כמה צבעים לייצר אותות בהירים יותר באופן עקבי יותר מאחרים. יש לנו תמיד משמשים DAPI (כחול) כcounterstain שהופך אלקסה פלואוריד 555 (אדום), 488 (ירוק), ו647 (הרבה אדום) בחירות טובות עבור תיוג בדיקות. עם מערכת ההדמיה שלנו, מצא אלקסה פלואוריד 555 (אדום) כדי לייצר את האותות הבהירים ביותר, ואחריו Alexa פלואוריד 488 (ירוק). יש Alexa פלואוריד 647 (הרבה אדום) חסרון שלא ניתן לאתר אותו על ידי העין האנושית ולכן לא ניתן לראות אותות כשמסתכלים למטה למיקרוסקופ. לכן, אם עושים דגים בשני צבעים, אנו ממליצים על שילוב של צבעים אדומים וירוקים.
שתי בעיות עיקריות שעשויות להתעורר: תאים לשטוף מעליו את השקופיות ואותות חלשים. כיצד תאים גם לדבוק בשקופית היא betw עצומה משתנהסוגי een סלולריים, ואת הפרוטוקול הטוב ביותר ליישב / תאי זרע צריך להיות נחושים. אנחנו השתמשנו בהצלחה גם מטען חשמלי חיובי או שקופיות מצופות פולי-L-ליזין (קנה מוכן לשימוש), אבל מצא תאים בדרך כלל דבקו טובים יותר לשקופיות מצופות פולי-L-ליזין. מצאו גם כי כאשר תאים היו אזורים שלמים צפופים מדי הייתם להתקלף כמו סדין, ואילו הדמיה אוטומטית הכבידה אם התאים היו דלילים מדי. לכן, אם המדגם הוא לא יקר מדי, יש זורעים מספרי תאים שונים כדי לקבוע את הצפיפות האידיאלית. אם תאים נוטים לשטוף במיוחד, ניתן להשתמש בעט מחסום הידרופובי, וניתן לבצע את הפעולות דגים על ידי pipetting בזהירות פתרונות ישירות על גבי שקופית. גם מפחית באופן דרסטי Pipetting הכרכים של חומרים כימיים הנחוצים, אבל לוקח זמן רב יותר במידה ניכרת כאשר עושה מספר שקופיות.
אותות חלשים הם בדרך כלל עקב בדיקות עניות, וזה בהחלט שווה להשקיע את הזמן לעשייה טוב. הנקי BAC-DNA יש להשתמשד כחומר מוצא אשר ניתן להשיג על ידי משקעים חוזרים ונשנים או ערכות זמינות מסחרי. זיהום חיידקים עם הדנ"א הגנומי משפיע לרעה על איכות בדיקה וטיפול זהיר במהלך תמוגה תא וסינון של lysate התא נדרש כדי לשמור אותו למינימום. , היא, לעומת זאת אין צורך להשתמש בצעד exonuclease לעיכול ה-DNA ליניארי, כמו זה מפחית תשואה במידה רבה. תיוג יעיל של הבדיקה הוא קריטי. בקרת האיכות החשובה ביותר של שלב זה היא לבדוק את גודל השבר לאחר תרגום ניק (ראה נציג תוצאות). למרוח 'טוב' כמעט תמיד יגרום לחללית צבעונית. עם זאת, מצאנו שמדי פעם BAC מסוים לא יכול להיות מעובד לתוך חללית טובה, וBAC שונה צריך להיות נבחרים. צעד חשוב נוסף הוא denaturation חום. אם הטמפרטורה נמוכה מדי, ה-DNA יהיה רק באופן חלקי מפוגל וכלת חללית תהיה לקויה. אם הטמפרטורה גבוהה מדי, מבנה הגרעיני wiתהיה מוטרד יותר ממה שנחוץ. בידיים שלנו, 78 מעלות צלזיוס בבלוק חם הפוך היא הפשרה האידיאלית, אבל זה עשוי להשתנות בהתאם לבלוק החם המתאים בשימוש.
היו לנו תוצאות טובות באמצעות הרכבה בינונית Vectashield, אבל גילינו שיש לו פחות זהב SlowFade רקע ומשמר את אות הניאון למשך זמן ארוך יותר. אנו לא ממליצים על שימוש בהרכבה בינונית קשה להגדיר כפי שמצאנו את זה כדי להשפיע על מבנה 3D וליצור בועות אוויר לאורך זמן.
לסיכום, בהיר בדיקות ניאון ישירות כותרתו יחד עם פרוטוקול FISH-DNA תואר כאן מציעות פתרון יעיל לניתוח חזק ומהיר של ארכיטקטורה גרעינית אשר חל על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי BBSRC וקרן Wellcome. ברצוננו להודות לסיימון ווקר לקבלת סיוע עם הדמיה ופליקס קרוגר לעזרה עם ניתוח bioinformatic.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
|