Se describe un protocolo robusto y versátil para el análisis de la arquitectura nuclear por FISH 3D DNA usando sondas fluorescentes marcados directamente.
3D PEZ ADN se ha convertido en una herramienta importante para el análisis de la organización tridimensional del núcleo, y varias variaciones de la técnica se han publicado. En este artículo se describe un protocolo que ha sido optimizado para la robustez, reproducibilidad y facilidad de uso. Brillantemente fluorescentes sondas directamente marcadas son generados por la mella con amino-allyldUTP seguido de acoplamiento químico del colorante. 3D PEZ ADN se lleva a cabo utilizando una etapa de congelación-descongelación para la permeabilización celular y una etapa de calentamiento para la desnaturalización simultánea de la sonda y el ADN nuclear. El protocolo es aplicable a una gama de tipos de células y una variedad de sondas (BAC, plásmidos, fosmids, o pinturas de todo el cromosoma) y permite la formación de imágenes automatizado de alto rendimiento. Con este método de manera rutinaria investigamos localización nuclear de hasta tres regiones cromosómicas.
ADN hibridación in situ fluorescente (FISH ADN) permite la visualización tridimensional de loci de genes individuales, dominios subchromosomal y cromosomas enteros incluso durante todas las etapas del ciclo celular. PEZ 2D se utiliza para los estudios en metafase mientras que los peces 3D se ha utilizado ampliamente para investigar la relación entre la organización espacial del genoma y su función durante la interfase (1,2 y las referencias en él). Históricamente, los estudios de co-asociación se realizaron mediante la investigación de decenas a cientos de loci individuales por FISH. Técnicas más recientemente potente de alto rendimiento basados en 3C como 4C y Hi-C se han desarrollado 3, lo que permite la investigación de cross-talk molecular entre muchos miles de diferentes loci. Mientras que las técnicas basadas 3C y FISH de ADN pueden ser métodos complementarios, que no necesariamente responden a las mismas preguntas. Métodos basados en 3C proporcionan una lectura de conjunto de poblaciones de células mixtas, lo que resulta en una probabilidaddad para los compañeros de las asociaciones. En contraste, mientras que la baja en el rendimiento, basados en técnicas de FISH ofrecen la posibilidad de analizar disposiciones espaciales de los loci o los cromosomas en las células individuales de acuerdo a sus etapas del ciclo de desarrollo o celular. Por lo tanto, PEZ, seguirá siendo una importante herramienta para sondear las relaciones estructura-función nucleares.
Hay dos consideraciones importantes en la realización de experimentos de FISH 3D exitosas. Estos son: 1. obtención de sondas marcadas de manera óptima y 2. elección de los tratamientos celulares, incluyendo la fijación, pre-y pasos posteriores a la hibridación, para preservar la morfología nuclear tanto como sea posible al tiempo que ADN suficientemente accesible para la hibridación de la sonda. Sonda de etiquetado eficiente es muy importante para los peces. Tradicionalmente, la mella se ha utilizado para introducir ya sea hapteno o nucleótidos fluoróforo conjugados con 4. Del mismo modo, los kits de la mella comerciales están disponibles para hapteno o incorporación directa fluoróforo, but también para dos pasos etiquetado utilizando nucleótidos aminoallyl y colorantes reactivos con amina. Este último hace que la incorporación de tinte más eficiente, dando una molécula de ADN polimerasa menos voluminoso que trabajar. Más recientemente, los kits para el etiquetado no enzimática de ADN se han desarrollado que explotan unión coordinativa de platino a los ácidos nucleicos. Sondas FISH incluso se pueden comprar ya marcado 5. Mientras que los kits y sondas fabricadas comercialmente sin duda le dan la facilidad de uso, son considerablemente más caro que comprar los componentes individuales y la producción de sondas en el local. Hemos optimizado un protocolo de traslado de cortes de bajo coste con el fin de etiquetar directamente a muchas diferentes sondas de alcoholemia en varios colores. Hemos descubierto que la obtención de ADN altamente puro BAC es crítico y los resultados en un requisito para sólo el 10-20 ng de sonda por diapositiva PEZ, en comparación con 10 – 20 veces más cuando se utiliza la plantilla de ADN impuro, lo que resulta en mayor costo y tiempo ahorros. El uso de amino-allyldUTP permite etiquetado flexible de lossondas con colorantes reactivos con amina disponibles (por ejemplo, Cy-colorantes Alexa Fluor o) o haptenos (por ejemplo, biotina, digoxigenina). Sondas de hapteno-etiquetados son detectados por anticuerpos conjugados con fluoróforo o estreptavidina para amplificar y visualizar la señal. Bright sondas directamente marcadas generalmente muestran menos tinción de fondo y evitar la sobre-amplificación de las señales, por lo tanto, lo que resulta en una representación más precisa de la localización nuclear y la morfología locus.
Hay varias técnicas de FISH diferentes que utilizan diferentes fijadores, pre-tratamientos, y lavados post-hibridación pero éstos generalmente se clasifican en las siguientes categorías: fijación de glutaraldehído con NaOH desnaturalización, fijación de formaldehído con HCl desnaturalización, y la fijación de formaldehído con desnaturalización por calor 6-9 . Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas. Glutaraldehído resultados fijación en buen estado de conservación estructural nuclear, pero requiere tratamiento con agentes reductores para reducir al mínimola autofluorescencia resultante, y tratamiento con NaOH necesita ser cuidadosamente controlado para equilibrar suficiente desnaturalización del ADN y la posibilidad de daños en la estructura nuclear 6. La fijación de formaldehído es menos fuerte, dando un aumento de la probabilidad de perturbaciones de la arquitectura nuclear, pero también suelen dar señales más bajas y autofluorescencia 9 más fuertes y más fiable. Tratamiento HCl depurinates ADN y tiras fuera proteínas, proporcionando un buen acceso al ADN de las sondas, pero también puede presentar roturas en el ADN. Calefacción separa físicamente las dos cadenas de ADN que resultan en buen objetivo de hibridación y las señales fuertes, pero puede causar alguna perturbación de la estructura nuclear 8. El grado en que cada una de estas técnicas afecta a epítopos de proteínas varía ampliamente 6,9, lo que resulta en el requisito para determinar experimentalmente para cada proteína el protocolo óptimo para utilizar en experimentos de inmuno-FISH.
Aunque no existe una "perfecta" ADN PESCADO technique, que todo puede ser útil si está bien controlado. Nuestro objetivo era optimizar un protocolo para robusto y reproducible PEZ ADN para investigar posicionamiento espacial de múltiples loci en una variedad de tipos de células 10, centrándose en el método de calentamiento para la mayoría de señales fiables. Con esto y el uso de un sistema automatizado de imágenes apuntamos a incrementar el rendimiento para el análisis de células individuales de los acuerdos nucleares.
3D PEZ ADN se ha convertido en una herramienta ampliamente reconocido para analizar disposiciones espaciales en el núcleo. Mientras que el pescado proporciona resultados visuales y directa, como con todas las técnicas, hay que ser conscientes de sus limitaciones. PEZ ADN se enfrenta el problema inherente de que se necesitan tratamientos relativamente duras para hacer accesible la cromatina para sondas FISH que en última instancia interrumpe la estructura-la misma cosa nuclear que se va a analizar. Varias estrategias se han seguido para hacer malabares con la accesibilidad y la conservación de la estructura. En el protocolo descrito aquí, el ADN cromosómico se hace accesible por congelación-descongelación permeabilización de las células y la desnaturalización por calor antes de la hibridación de la sonda. Solovei, et al., (2002) analiza los cambios estructurales después de un tratamiento similar y se encontró que el desplazamiento medio de dominios de la cromatina era 300 nm, lo que limita la resolución del análisis estructural a aproximadamente 1 Mb regiones en el genoma 8. Si bien esto no es de alta resolución, sees una escala razonable para el análisis de la posición nuclear.
Una consideración más práctica para el análisis de FISH es que la adquisición y mediciones de distancias nucleares imagen son procesos que consumen tiempo que limitan el número de núcleos que se puede analizar. Para el estudio de los eventos poco frecuentes que nos propusimos hacer imágenes de alto rendimiento automatizado. Entonces, con los controles adecuados en su lugar, un número suficiente se pueden comparar para permitir un análisis estadístico robusto de las relaciones espaciales. Se analiza rutinariamente 600 núcleos por punto de datos para la que se determina las coordenadas 3D de todas las señales de FISH en el volumen nuclear. Estos datos requieren muy poco espacio de almacenamiento y permitir el análisis de las distancias inter-e intra-alélica, o posiciones radiales en cualquier momento posterior. Por otra parte, el procesamiento automatizado se puede hacer de una manera ciega investigador que reduce en gran medida la probabilidad de sesgo inconsciente.
Para habilitar este tipo de analys de alto rendimientoes que nuestro objetivo era establecer una forma rápida y eficiente de realizar PESCADO ADN. Encontramos el protocolo descrito aquí para ser extremadamente robusto, produciendo constantemente señales luminosas con bajo fondo. Se trabajó para todos los tipos de células que probamos siempre y cuando adaptó la etapa de fijar las células a la diapositiva. Por otra parte, con una excepción, todos los BACs que utilizamos podrían convertirse en sondas luminosas. También hemos detectado con éxito una serie de proteínas nucleares mediante la tinción de anticuerpos después PESCADO ADN. Mientras que para algunas proteínas que esto funciona así, se recomienda la comparación con inmunofluorescencia tradicional (IF) para asegurar la consistencia del patrón de tinción de anticuerpos entre IF y el ADN inmuno FISH (comparación 11).
En general, se encontró que las sondas marcadas en diferentes colores producen los mismos resultados. Sin embargo, los siguientes aspectos deben ser considerados al momento de elegir el tinte de etiquetado. En primer lugar, el color del fluoróforo tiene que ser así detectable por el microscopio used. En segundo lugar, la longitud de onda de la luz emitida por los fluoróforos debe ser suficientemente diferente para evitar sangrado a través en el otro canal. Esto dependerá de los filtros en el microscopio. Y en tercer lugar, al menos en nuestras manos, algunos colores producen señales luminosas más consistente que los demás. Siempre hemos utilizado DAPI (azul) como de contraste que hace Alexa Fluor 555 (rojo), 488 (verde) y 647 (rojo lejano) buenas opciones para marcar sondas. Con nuestro sistema de formación de imágenes, encontramos Alexa Fluor 555 (rojo) para producir las señales más brillantes, seguido por Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (rojo lejano) tiene la desventaja de que no puede ser detectada por el ojo humano y por lo tanto no hay señales puede ser visto cuando mirando hacia abajo el microscopio. Por lo tanto, si al hacerlo PESCADO dos colores, se recomienda la combinación de tintes rojos y verdes.
Pueden surgir dos problemas principales: las células de lavado de las diapositivas y las señales débiles. Cómo las células y se adhieren a la diapositiva es entr enormemente variablestipos de células een, y el mejor protocolo para resolver / semillas de las células tiene que ser determinado. Hemos utilizado con éxito ya sea con carga positiva o portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina (comprado listo para usar), pero encontramos células generalmente se adhirieron mejor a portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina. También se encontró que cuando las células eran zonas enteras demasiado densos haría pelar como una hoja, mientras que las imágenes automatizado se vio obstaculizado si las células eran demasiado escasa. Por lo tanto, si la muestra no es demasiado precioso, diferentes números de células se sembraron para determinar la densidad ideal. Si las células son particularmente propensos a lavar, una pluma barrera hidrófoba se puede utilizar, y pasos de FISH se puede realizar por pipeteo cuidadosamente soluciones directamente sobre el portaobjetos. Pipetear también reduce drásticamente los volúmenes de reactivos necesarios, pero lleva mucho más tiempo al hacer varias diapositivas.
Señales débiles son por lo general debido a las sondas pobres, y es bien vale la pena invertir tiempo en hacer buenos. Clean BAC ADN debe utilizard como material que puede ser obtenido por precipitación repetida o kits disponibles comercialmente de partida. La contaminación con ADN genómico bacteriano afecta negativamente a la calidad de la sonda y el manejo cuidadoso durante la lisis celular y la filtración del lisado celular se requiere para mantener a un mínimo. Es, es, sin embargo, no es necesario utilizar un paso exonucleasa para digerir ADN lineal, ya que esto reduce en gran medida el rendimiento. Etiquetado de la eficiencia de la sonda es crucial. El control de calidad más importante de este paso es la comprobación del tamaño de los fragmentos después de la traducción nick (ver resultados representativos). Una "buena" desprestigio casi siempre como resultado una sonda de colores brillantes. Sin embargo, hemos encontrado que de vez en cuando una cierta BAC no se puede procesar en una buena sonda, y un BAC diferente debe ser elegido. Otro paso importante es la desnaturalización por calor. Si la temperatura es demasiado baja, el ADN será sólo parcialmente desnaturalizado y la hibridación de la sonda se verá perjudicada. Si la temperatura es demasiado alta, la estructura wi nuclearll ser perturbado más de lo necesario. En nuestras manos, 78 ° C en un bloque caliente invertida es el compromiso ideal, pero esto puede variar dependiendo del bloque caliente respectivos usado.
Hemos tenido buenos resultados con medio de montaje Vectashield, pero encontró que SlowFade oro tiene menos fondo y preserva la señal fluorescente durante más tiempo. No se recomienda el uso de medio de montaje dura-set, ya que encontramos que esto afecte la estructura 3D y formar burbujas de aire en el tiempo.
En conclusión, brillantemente fluorescentes sondas marcadas directamente junto con el protocolo de PEZ ADN descrito aquí ofrecen una solución eficiente para el análisis de forma fiable y rápida de la arquitectura nuclear, que es aplicable a una amplia variedad de cuestiones biológicas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el BBSRC y el Wellcome Trust. Nos gustaría dar las gracias a Simon Walker para obtener ayuda con imágenes y Felix Krueger para ayudar con el análisis bioinformático.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
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