We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.
3D DNA FISH is uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor het analyseren van de driedimensionale organisatie van de kern, en de verschillende varianten van de techniek zijn gepubliceerd. In dit artikel wordt een protocol dat is geoptimaliseerd voor robuustheid, reproduceerbaarheid, en gebruiksgemak beschrijven we. Fel fluorescerend direct gelabelde probes worden gegenereerd door nick-translatie met amino-allyldUTP gevolgd door chemische koppeling van de kleurstof. 3D DNA FISH wordt uitgevoerd met een vries-dooi stap cel permeabilisatie en een verwarmingsstap voor gelijktijdige denaturatie van probe en nucleair DNA. Het protocol is voor diverse celtypes en verschillende probes (BACs, plasmiden, fosmids of Whole chromosoom Paints) en maakt hoge-doorvoer geautomatiseerde beeldvorming. Met deze methode hebben we routinematig nucleaire lokalisatie van maximaal onderzoeken tot drie chromosomale gebieden.
DNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH DNA) kan de driedimensionale visualisatie van afzonderlijke loci, subchromosomale gebieden en zelfs hele chromosomen gedurende alle fasen van de celcyclus. 2D FISH wordt gebruikt metafase studies terwijl 3D FISH is uitgebreid gebruikt om de relatie tussen de ruimtelijke organisatie van het genoom en functionaliteit tijdens interfase (1,2 en referenties daarin) probe. Historisch gezien werden co-associatie studies door onderzoek tientallen tot honderden afzonderlijke loci door FISH. Recenter krachtige high throughput 3C-gebaseerde technieken zoals 4C en Hi-C ontwikkeld 3, waarbij het onderzoek van de moleculaire interactie tussen vele duizenden verschillende loci. Terwijl 3C-gebaseerde technieken en DNA FISH kan complementair zijn methoden, doen ze niet per se dezelfde vragen te beantwoorden. 3C gebaseerde methoden een ensemble uitlezen van gemengde celpopulaties, resulterend in een probabilheid voor co-verenigingen. Daarentegen, terwijl weinig doorvoer FISH gebaseerde technieken bieden de mogelijkheid om ruimtelijke schikking van loci of chromosomen in individuele cellen te analyseren op basis van hun ontwikkeling of mobiele fasen. Daarom zal FISH blijven een belangrijk instrument voor het sonderen van de nucleaire structuur-functie relaties zijn.
Er zijn twee belangrijke overwegingen bij het succesvolle 3D-FISH experimenten uitvoeren. Deze zijn: 1. verkrijgen van optimaal gemerkte probes en 2. keuze van cellulaire behandelingen, zoals fixatie, pre-en post-hybridisatie stappen nucleaire morfologie zoveel mogelijk te behouden terwijl het DNA voldoende toegankelijk voor probe hybridisatie. Efficiënte sonde etikettering is van cruciaal belang voor FISH. Traditioneel is nick-translatie is gebruikt in te voeren ofwel hapten of fluorofoor-geconjugeerde nucleotiden 4. Ook commerciële nick-translatie kits zijn beschikbaar voor directe hapten of fluorofoor incorporatie, BUt ook voor tweefasige labeling met aminoallyl nucleotiden en amine-reactieve kleurstoffen. Levert deze laatste kleurstof incorporatie efficiënter door het geven van DNA-polymerase een minder omvangrijk molecuul om mee te werken. Meer recent zijn kits voor de niet-enzymatische labeling van DNA ontwikkeld die coördinatieve binding van platina nucleïnezuren benutten. FISH probes kunnen ook gekocht worden al bestempeld 5. Terwijl kits en commercieel vervaardigd sondes geen twijfel geven gebruiksgemak, ze zijn aanzienlijk duurder dan het kopen van de afzonderlijke componenten en het produceren van sondes in-house. We geoptimaliseerd een low cost nicktranslatie protocol om direct labelen veel verschillende BAC probes in meerdere kleuren. We ontdekten dat het verkrijgen van zeer zuivere BAC DNA is kritisch en leidt dat slechts 10-20 ng probe per FISH slide, vergeleken met 10 – 20-maal als onzuiver DNA template wordt gebruikt, die weer belangrijke kosten-en tijd- besparingen. Het gebruik van amino-allyldUTP een flexibele etiketteringsondes met beschikbare amine-reactieve kleurstoffen (bv. Alexa Fluor of Cy-kleurstoffen) of haptenen (bv biotine, digoxigenine). Hapteen-gelabelde probes worden gedetecteerd door fluorofoor-geconjugeerde antilichamen of streptavidine aan te vullen en visualiseren signaal. Bright direct gelabelde probes vertonen doorgaans minder achtergrondkleuring en voorkomen dat over-amplificatie van signalen, dus resulterend in een nauwkeurigere representatie van nucleaire lokalisatie en morfologie locus.
Er zijn verschillende FISH technieken die gebruik maken van verschillende fixatieven, pre-behandelingen, en post-hybridisatiewassingen maar deze algemeen vallen in de volgende categorieën: glutaaraldehyde fixatie met NaOH denaturatie, formaldehyde fixatie met HCl denaturatie, en formaldehyde fixatie met warmte denaturatie 6-9 . Elk van deze heeft voordelen en nadelen. Glutaaraldehyde fixatie resulteert in goede nucleaire structurele conservering, maar vereist een behandeling met reducerende middelen tot een minimum te beperkende resulterende autofluorescentie en NaOH behandeling moet zorgvuldig worden gecontroleerd om voldoende DNA denaturatie en mogelijke schade aan de kernstructuur 6 evenwicht. Formaldehyde fixatie minder sterk, hetgeen een verhoogde kans op storingen van nucleaire architectuur, maar ook typisch geven sterker en betrouwbaarder signalen en lage autofluorescentie 9. HCl behandeling depurinates DNA en strips uit eiwitten, biedt goede toegang tot het DNA van de sondes, maar kunnen ook tot DNA-breuken. Verwarming fysiek scheidt de twee DNA-strengen resulteert in goed doelwit hybridisatie en sterke signalen, maar kan enige verstoring van de nucleaire structuur 8 veroorzaken. De mate waarin elk van deze technieken beïnvloedt eiwitepitopen 6,9 varieert sterk, waardoor het vereiste om experimenteel te bepalen voor elk eiwit de optimale protocol te gebruiken in immuno-FISH experimenten.
Hoewel er geen 'perfecte' DNA FISH technique, ze kunnen allemaal nuttig zijn als goed gecontroleerd. Ons doel was om een protocol voor robuuste en reproduceerbare DNA FISH optimaliseren ruimtelijke positie van meerdere loci onderzocht in verschillende celtypes 10, gericht op de verwarmingsmethode voor de meest betrouwbare signalen. Met deze en het gebruik van een geautomatiseerd imaging systeem dat we het verhogen van de doorvoer voor single cell analyse van nucleaire regelingen.
3D DNA FISH is uitgegroeid tot een algemeen erkend instrument om ruimtelijke regelingen te analyseren in de kern. Terwijl FISH biedt visuele en directe resultaten, zoals met elke techniek, moet men zich bewust zijn van de beperkingen ervan. DNA FISH wordt geconfronteerd met de inherente probleem dat relatief agressieve behandelingen zijn nodig om chromatine toegankelijk voor FISH probes die uiteindelijk verstoort nucleaire structuur-de zeer ding dat moet worden geanalyseerd maken. Verschillende strategieën werden gevolgd om de toegankelijkheid en de structuur behoud jongleren. In het hier beschreven protocol, wordt chromosomaal DNA bereikbaar met vries-dooi permeabilisatie van cellen en warmte denaturatie voorafgaand aan probe hybridisatie gemaakt. Solovei, et al.. (2002) analyseerden structurele veranderingen na vergelijkbare behandeling en vond dat de gemiddelde verplaatsing van chromatinedomeinen was 300 nm waarbij de oplossing van structurele analyse beperkt tot ongeveer 1 Mb gebieden in het genoom 8. Hoewel dit niet een hoge resolutie, hetis een redelijke schaal voor het analyseren van de nucleaire positie.
Een praktische overweging voor FISH analyse is dat beeldacquisitie en metingen van nucleaire afstanden tijdrovende processen die het aantal kernen die kunnen worden geanalyseerd beperken. Om te studeren zelden voorkomende gebeurtenissen willen wij aan high throughput geautomatiseerde beeldvorming doen. Dan, met geschikte controles plaats, voldoende kunnen worden vergeleken om voor robuuste statistische analyse van ruimtelijke relaties. We routinematig analyseren 600 kernen per datapunt waarvoor wij bepalen de 3D-coördinaten van alle FISH signalen binnen de nucleaire volume. Deze gegevens vereisen zeer weinig opslagruimte en zorgen voor de analyse van de inter-en intra-allelische afstanden, of radiale posities op een later moment. Bovendien kunnen automatische verwerking worden gedaan in een onderzoeker blinde manier die sterk vermindert de kans op onbewuste vooroordelen.
Om dit soort high throughput analys stellenis, ons doel was om een snelle en efficiënte manier van het uitvoeren van DNA-FISH vestigen. We vonden het hier beschreven protocol te zijn uiterst robuust, consistent produceren van heldere signalen met een lage achtergrond. Het werkte voor alle celtypes we probeerden op voorwaarde dat we aangepast de stap van het bevestigen van de cellen aan de dia. Bovendien, met een uitzondering, alle BAC's gebruikten we konden worden omgezet in heldere sondes. We hebben ook met succes een aantal nucleaire proteïnen gedetecteerd door antilichaamkleuring na DNA FISH. Terwijl voor sommige eiwitten dit goed werkt, raden we vergelijking met traditionele immunofluorescentie (IF) om de consistentie van het antilichaam kleuringspatroon tussen IF en DNA immuno FISH (vergelijk 11) te garanderen.
Algemeen vonden we dat probes kleur gemarkeerd geproduceerd dezelfde resultaten. Echter, de volgende aspecten worden beschouwd bij het kiezen van de etikettering kleurstof. Ten eerste, de kleur van de fluorofoor moet wel detecteerbaar zijn door de microscoop used. Ten tweede moet de golflengte van het licht dat door de fluoroforen voldoende verschillend om randen te voorkomen door in het andere kanaal. Dit zal afhangen van de filters in de microscoop. En ten derde, althans in onze handen, sommige kleuren produceren heldere signalen constanter dan anderen. We hebben altijd DAPI (blauw) als tegenkleuring die Alexa Fluor 555 (rood), 488 (groen) maakt, en 647 (ver rood) goede keuzes voor het labelen van probes. Met onze afbeeldingssysteem vonden we Alexa Fluor 555 (rood) de meest heldere signalen, gevolgd door Alexa Fluor 488 (groen) te produceren. Alexa Fluor 647 (ver rood) heeft het nadeel dat het niet kan worden gedetecteerd door het menselijk oog en dus geen signalen zichtbaar zijn wanneer bekeken langs de microscoop. Dus, als het doen van twee-kleuren FISH, adviseren wij de combinatie van rode en groene verf.
Twee belangrijke problemen kunnen ontstaan: cellen wassen uit de dia's en zwakke signalen. Hoe goed cellen zich te houden aan de glijbaan is enorm variabel tussEEN celtypen, en de beste protocol / zaad van de cellen moet worden bepaald vestigen. We hebben met succes gebruikt voor hetzij positief geladen of Poly-L-lysine beklede objectglaasjes (gekocht gebruiksklaar), maar vond cellen gehecht algemeen beter Poly-L-lysine beklede objectglaasjes. We vonden ook dat wanneer de cellen waren te dichte hele gebieden zou afpellen als een blad, terwijl geautomatiseerde beeldvorming werd gehinderd als de cellen waren te schaars. Dus, indien het monster niet te kostbaar, verschillende celaantallen worden gezaaid op het ideale dichtheid bepalen. Als cellen zijn bijzonder gevoelig voor wassen, kan een hydrofobe barrière pen gebruikt en FISH stappen kunnen worden uitgevoerd door zorgvuldig pipetteren, rechtstreeks op het glaasje. Pipetteren ook drastisch vermindert de volumes van reagentia nodig zijn, maar duurt aanzienlijk langer bij het doen van meerdere dia's.
Zwakke signalen zijn meestal te wijten aan slechte sondes, en het is de moeite waard om te investeren tijd in het maken van goede. Schoon BAC DNA moet worden gebruiktd als uitgangsmateriaal kan worden verkregen door herhaalde precipitatie of commercieel verkrijgbare kits. Verontreiniging met bacterieel genomisch DNA negatief effect probe kwaliteit en zorgvuldige behandeling tijdens cellysis en filtreren van het cellysaat nodig om het te minimaliseren. Het is echter niet nodig om een exonuclease stap om lineaire DNA verteren, omdat dit sterk vermindert opbrengst. Efficiëntie-etikettering van de sonde is cruciaal. De belangrijkste kwaliteitscontrole voor deze stap is het controleren van het fragment grootte na nicktranslatie (zie Representatieve resultaten). Een 'goede' uitstrijkje zal bijna altijd resulteren in een felgekleurde sonde. Wij hebben echter gevonden dat soms een zekere BAC niet kan worden verwerkt tot een goede probe en een verschillende BAC moet worden gekozen. Een andere belangrijke stap is warmte denaturatie. Als de temperatuur te laag is, zal het DNA gedeeltelijk gedenatureerde probe hybridisatie worden geschaad. Als de temperatuur te hoog is, nucleaire structuur will worden verstoord meer dan nodig. In onze handen 78 ° C op een omgekeerde hete blok het ideale compromis, maar kan variëren naargelang de gebruikte respectievelijke hete blok.
We hebben goede resultaten met behulp Vectashield montage medium had, maar vond dat Slowfade Gold heeft minder achtergrond en behoudt het fluorescerende signaal voor langer. Wij raden het gebruik van hard-set montage medium aanbevelen als we vonden dit invloed 3D-structuur en luchtbelletjes vormen in de tijd.
Concluderend helder fluorescent gemerkte probes direct samen met de DNA FISH hier beschreven protocol biedt een efficiënte oplossing voor robuuste en snelle analyse van nucleaire architectuur die toepassing op een breed scala aan biologische vragen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de BBSRC en de Wellcome Trust. Wij willen Simon Walker bedanken voor hulp bij beeldvorming en Felix Krueger voor hulp bij bio-analyse.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
|