Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen. Ein<em> In vivo</em> Zwei-Photonen-Imaging-Verfahren wird hier das ermöglicht die Rückverfolgung von molekularen Veränderungen in den einzelnen kortikalen Neuronen durch genetisch kodierte Reporter beschrieben.
Die Fähigkeit des Gehirns als Reaktion auf Erfahrungen zu ändern ist wichtig für gesunde Funktion des Gehirns, und Anomalien in diesem Prozess beitragen zu einer Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns 1,2. Zum besseren Verständnis der Mechanismen, durch die Schaltkreise des Gehirns reagieren auf eines Tieres Erfahrung erfordert die Fähigkeit, die Erfahrung angewiesen molekulare Veränderungen in einer bestimmten Gruppe von Neuronen zu überwachen, die über einen längeren Zeitraum, in dem lebenden Tier. Während die Erfahrung und die damit verbundenen neuronalen Aktivität ist bekannt, dass Veränderungen der Genexpression in Nervenzellen 1,2 auslösen, die meisten der Methoden, um solche Veränderungen zu erkennen erlauben nicht wiederholte Beobachtung der gleichen Neuronen über mehrere Tage oder keine ausreichende Auflösung zu beobachten einzelnen Neuronen 3 , 4. Hier beschreiben wir eine Methode, die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit einem genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter Erfahrungen abhängigen Veränderungen der Genexpression in einzelnen kortikalen Neuronen über die Strecke Laufe des Tages-to-day Erfahrung.
Einer der gut etablierten Erfahrung abhängigen Genen ist Activity-regulierten Zytoskelett assoziierten Protein (Arc) 5,6. Die Transkription von Arc wird schnell und stark von verstärkten neuronalen Aktivität 3 induziert wird, und dessen Proteinprodukt reguliert die Endozytose von Glutamatrezeptoren und langfristige synaptischen Plastizität 7. Die Expression von Arc wurde weithin als molekularer Marker neuronaler Schaltkreise in spezifischen Verhaltensweisen 3 beteiligten Karte verwendet. In den meisten dieser Studien wurde Arc-Expression durch in situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie in festen Gehirnschnitte detektiert. Obwohl diese Methoden ergab, dass die Expression von Arc auf eine Teilmenge von erregenden Neuronen nach Verhaltensstörungen Erfahrung, wie die zellulären Strukturen des Arc Ausdruck kann mit mehreren Episoden von wiederholten oder besondere Erfahrungen über Tage zu ändern wurde nicht untersucht wurde lokalisiert.
ntent "> In vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie ein guter Weg, um Erfahrungen-abhängige zelluläre Veränderungen im lebenden Gehirn 8,9 untersuchen bietet. Um die Prüfung der Arc Ausdruck in Live-Neuronen durch Zwei-Photonen-Mikroskopie zu ermöglichen, haben wir vorher erzeugte einen Dominoeffekt in Maus, in der ein GFP-Reporter steht unter der Kontrolle des endogenen Promotor Arc 10 platziert. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Vorbereitungen und bildgebenden Verfahren zum Verfolgen erfahrungsabhängiger Arc-GFP-Expression in neuronalen Mustern Ensembles in dem lebenden Tier. Bei diesem Verfahren , chronische kranialen Fenster wurden zuerst in Arc-GFP-Mäuse in den kortikalen Regionen von Interesse implantiert. Die Tiere wurden dann wiederholt durch Zwei-Photonen-Mikroskopie nach gewünschten Verhaltensänderungen Paradigmen im Laufe von mehreren Tagen abgebildet. Diese Methode kann allgemein für Tiere, die anderen fluoreszierenden Reporter Erfahrung-abhängigen molekularen Veränderungen 4.Die in-vivo-Bildgebung hier beschriebene Methode ermöglicht die wiederholte Untersuchung des Arc Veränderungen der Genexpression in den gleichen Gruppen von Neuronen über mehrere Tage im lebenden Tier. Es ist eine effiziente und vielseitige Methode, um Informationen über neuronale Plastizität verwandte molekulare Dynamik in einzelnen Neuronen in Reaktion auf verschiedene Verhaltensweisen Erfahrungen zu erhalten. Standard histochemische Verfahren wie in situ Hybridisierung und Immunfärbung kann ei…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei L. Belluscio für Chirurgie Filmtechnik, D. Kwon danke für die Dreharbeiten Unterstützung, Bearbeitung K. Liu für Video-Unterstützung und K. MacLeod für alle Hintergrundmusik. KW erkennt die großzügige Unterstützung der NIMH Division of Intramural Forschungsprogramme und die Gene, Cognition and Psychosis Program. Diese Arbeit wurde von der NIMH Intramural Research Program (VC, YY, SMKW) und der NIAAA Division of Intramural Klinische und Biologische Research Program (VC, RMC, DML) unterstützt.
Name of the Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |