跟踪突触连接的神经元的方法。我们使用TVA特异性的上游电池,探测是否感兴趣的接收的细胞群体突触输入从基因定义的细胞类型。
古典方法研究神经回路是相当低的吞吐量。病毒跨突触,特别是伪狂犬(PRV)和狂犬病毒(RABV),,最近水泡性口炎病毒(VSV),学习电路,正变得越来越流行。这些高通量的方法使用顺行或逆行方向的神经元之间传递的病毒。
近日,RABV突触逆行追踪。 ( 图1A)。在这种方法中,糖蛋白(G)的基因被删除从病毒基因组中,仅在目标神经元和补给。感染特异性达到代的嵌合G,ASLV-阿糖蛋白和胞质域的RABV-G(A / RG)的胞外结构域组成,正常RABV-G 1。特别是感染这种嵌合G TVA受体1的表达。该基因编码TVA已经Delivered通过各种方法2-8。 RABV-G感染的TVA表达神经元,RABV可以传输到其他突触连接的神经元在逆行方向的性质,这是交付的TVA受体的G。这种技术标签相对大量的输入(5-10%)2到一个定义的细胞类型,提供了一个采样到一个定义的起动器的细胞类型中的所有的输入。
我们最近修改了这个技术的使用VSV作为一个跨突触示踪9。 VSV有几个好处,包括快速的基因表达。在这里,我们详细介绍了新的病毒跟踪系统,使用VSV有用的探测微型电路与更高的分辨率。在原来的出版策略,由威克沙姆等。4和贝尔等人。9许可证标记神经元的任何项目上最初感染TVA-表达细胞,在这里VSV被设计仅传输到电视A-细胞( 图1B)。该病毒是第一个假RABV-G允许感染下游TVA表达神经元的神经元。这个第一群细胞感染后,病毒发布只能感染TVA-表达细胞。由于跨突触的病毒传播是有限的TVA-细胞的自定义类型的细胞连接的情况下,存在可以被探索和高分辨率。这些实验是在图2中所示的实验流程图。在这里,我们展示一个模型电路,在小鼠视网膜的方向选择性。我们考察爆无长突细胞(SACS)的连通性视网膜神经节细胞(RGC)。
使用病毒来研究神经回路是一个相对较高的吞吐量,连接神经元的分析方法。但是,生成,VSV和RABV病毒颗粒是不平凡的。虽然提供了上面列出的用于从cDNA拯救病毒的协议,它仍然是一个低概率事件。水平的每一个的N,P和L的质粒中需要被精确地调整,需要做的工作,以确保病毒救援和许多试验和复制。将一个完整的VSV基因组RNA的核苷酸颗粒的形成是一个低概率事件,因此可能需要多次尝试。这?…
The authors have nothing to disclose.
我们想感谢肖恩·惠兰与拯救重组VSV变种的协助,以及技术援助的Didem的戈兹贝达和Ryan Chrenek为。这项工作是由霍华德休斯医学研究所(CLC),NS068012-01(KTB)。
Reagent | Company | Catalogue number | |
Tissue Culture | |||
Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
Viral Centrifugation | |||
Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
Mouse Injection | |||
Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
Stereotax | Narishige | SR-5M | |
Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
Ethanol | Sigma | 493511 | |
Iodine | Sigma | PVP1 | |
Surgery and Dissection tools | |||
Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
Dissection and antibody staining | |||
paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
Antibodies | |||
Antibodies | millipore | AB144P | |
Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Tissue mounting | |||
Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |