Протокол для подготовки надежных, мелких HeLa ядерных экстрактов описано. Этот протокол является ценным для анализов, которые требуют использования небольших популяциях клеток, таких как клетки, обработанные с наркотиками или РНК-интерференции. Этот метод должен быть использован для широкого спектра экспрессии генов анализов и другие типы клеток, включая клетки пациента.
Большой прогресс в понимании выражения гена были сделаны с использованием в системах пробирке. Для большинства исследований, функциональные тесты проводятся с использованием экстрактов, которые готовятся в объеме от 10-50 и более литров клетки, выращенные в виде суспензии. Тем не менее, эти крупномасштабные препараты не поддаются быстрого тестирования в лабораторных эффектов, которые в результате различных в естественных условиях сотовой лечения или условий. В этой статье журнал видео показывает способ получения функциональных мелких ядерных экстрактов с помощью клеток HeLa в качестве примера. Этот метод осуществляется с помощью всего лишь три 150 мм пластинах клеток, выращенных в качестве сторонника монослоев. Для иллюстрации эффективности небольшой выдержки, мы покажем, что они так активно, как масса ядерных экстрактов для связанной РНК-полимеразы II транскрипции / сращивания реакций. Чтобы продемонстрировать полезность экстракт протокол, мы показали, что сращивание отменена экстракты получены из клетки HeLaс получавших ингибитор сращивания наркотиков E7107. Мелкие протокол должен быть вообще применимо к любой процесс или тип клеток, которые могут быть исследованы в лабораторных использованием клеточных экстрактов. К ним относятся клетки пациента, которые доступны только в ограниченном количестве или клетки подвергаются многочисленным агентов, таких как наркотики, ДНК-повреждающих агентов, РНК-интерференции, или трансфекции, которые требуют использования небольших клеточных популяций. Кроме того, небольшое количество свежего вырос клетки удобны и / или необходимых для некоторых приложений.
Мы создали быстрый и воспроизводимый способ получения ядерного экстракта из небольшого количества клеток HeLa выращивают как монослоев. Мы показали, что эти экстракты являются устойчивыми, показывая, что кинетика и эффективность РНКП II транскрипции / сращивания тесты похожи на мелких и сыпучих ядерных экстрактов. Мы показали полезность экстракты, продемонстрировав, что экстракты получены из клеток, обработанных с наркотиками ингибитор сплайсинга являются активными для транскрипции, но дефект склейки.
Наш способ получения мелких ядерных экстрактов была создана путем объединения и оптимизации методов ранее установленные для изготовления экстракта из клеток HeLa выращивают в суспензии в крупномасштабных 1,8 и метод для малого подготовки экстрактов 9. Мы создали наш протокол, потому что предыдущие мелкие экстракты были не работает для некоторых тестов, таких как связанных транскрипции / зрlicing анализа. Важное различие между предыдущими небольшой протокол 9 и наша в том, что мы оптимизировали условия для лизиса клеток с использованием мини-Dounce в то время как предыдущий протокол лизированных клеток толкает их через небольшую иглу 9. Иглой приводит к лизису пузырей, которые могут объяснить, почему экстракты были неактивны и / или трудно воспроизвести некоторые анализы. Мы также добавили в концентрации шаг к нашей протокола. Этот шаг повышает активность экстрактов, которые крайне чувствительны к концентрации, а также ограничивает изменчивость между экстрактов, которые присущи мелким препаратов. Наконец, наша подготовка обычно проводится только с тремя 150 мм пластин монослоя клеток, без существенного влияния на деятельность по сравнению с объемной экстрактов. Таким образом, процедура легко поддается для мелких препараты, которые требуют дорогостоящих реагентов или ограниченная доступность клетки. Например, мы подготовили SMALL-шкала выдержки из клеток RNAi нокдаун и от хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) клетки пациента, и использовать эти экстракты для функциональных и / или биохимические анализы (EGF, JLH, ТУ и РР, не опубликовано). Мы обнаружили, что экстракт ценны для RNAi следуют конкретные биохимические анализы, такие как immunopreciptations, вестерны, и серебрения. После установления эффективности сбить с особым белком, более детальное исследование может быть осуществлено путем стабильного нокдаун клеточных линий, которые могут быть использованы для получения дополнительной выдержки при меньших затратах. Масс-спектрометрия белков, присутствующих в иммунопреципитатах, полученные из этих линий нокдаун ячейка также будет полезно применение метода. В дополнение к связанной транскрипции / сращивания анализ, который мы использовали в качестве примера для наших протокол описание здесь небольшой выдержки должно быть вообще применимо к многочисленным функциональным и биохимические анализы, такие, как те, которые используются для различных гоEPS в экспрессии генов (например, укупорки, сплайсинг, транскрипция, полиаденилирования, микроРНК обработки). Протокол также может быть адаптирована для пациента типов клеток, которые могут быть получены либо в виде суспензии (таких, как ХЛЛ клеток) или выращенные в культуре (например, пациент фибробластов). Наконец, в цитоплазматической фракции, полученные в ходе процедуры должны оказаться полезными как для функциональных и биохимических анализов, которые требуют от цитоплазмы.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны М. Winkelbauer-Херт, Е. Ибрагим, П. Валенсии, К. Dufu, H. Cheng за полезные обсуждения. HeLa клетки были получены из Национального центра культуры клеток (Миннеаполис, Миннесота). Мы также благодарим Eisai Co, Ltd для обеспечения E7107 и Nikon Imaging центр в Гарвардской медицинской школе за помощью световой микроскопии. Эта работа была поддержана грантом NIH GM043375 руб и EGF и НРСА общение с JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.