タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー

1。マイクロ流体ミキシングチップの作製 図3は、基本的な製造工程を示しています。 ⅰ）熱硫酸130°Cまでして過酸化物に注ぐ：4インチ（100 mm）の新鮮なピラニア溶液（H 2 O 2 3：01 H 2 SO 4）と石英ウェーハをクリーニングします。表面粗さと石英ウェーハの平坦度は、最終的な接着工程のために重要な役割を果たして使用されることに注意してください。 ii）少なくとも30分間ウェーハを浸します。 ⅲ）水と乾燥で5分間リンスします。多結晶シリコン（ポリ）コーティングを適用するには、低圧化学蒸着（LPCVD）炉を用いて、最終的なマイクロ流体チャネルのあらゆる意図10μmの深さごとに厚さ〜1μmであり、。 手順1.1でピラニアプロトコルを使用してウェーハとマスクを清掃してください。マスクを同じ方法で清掃し、アセトン、メタノール、イソプロパノールで洗浄し、直ちに乾いた打撃。 15℃のホットプレート上でウェーハを脱水0°Cのために〜10分（離れて微粒子を維持するためにアルミ箔のテントを使用）か、または少なくとも120分（一晩できれば）120℃のオーブンインチフォトレジストの密着性を向上させるために、すぐに5分間HMDS蒸気に暖かいウェーハを公開します。 °Cに直接1分間ホットプレート上で、または30分（ 図3、ステップ1）の110℃のオーブンで90 AZ5214フォトレジストおよびソフトベークしています〜900nmの厚さの層を有するスピンコートは、ウェーハ。 マスクの位置を合わせ、ハード、真空接触する。 （ 図3、ステップ2）：数秒のために紫外光（〜103 mJの/ cm 2の全エネルギー）を公開します。穏やかに攪拌しながらAZ400K開発者と開発し、約50秒（フォトレジストが完全に開発されるまで）のDI水で4:1希釈した。 2分間水で洗い流してください。顕微鏡の機能（ 図3、ステップ3）を点検します。機能が不完全に解決されている場合は、フォトレジストを除去し、1.2から再起動します。ハードベーク115°Cに直接2のホットプレート上で分です。 100 WのRF電力で2.5分間アッシャーまたはO 2プラズマによるデスカムウェーハ。深い反応性イオンエッチング（DRIE）は、以下の石英ガラスに至るまでエッチングポリシリコン層は、すべての方法を使用します。 PRS2000 75℃ストリッパーをレジスト℃で10分間で残りのフォトレジストを取り除く。すすぎと乾燥させます。それはポリコーティング（ 図3、ステップ4）を介してすべての道であることを確認しエッチング深さを測定します。 そのようなアルバックNLD-6000エッチャー、ポリコーティング（ 図3、ステップ5）のミクロン厚さ当たり〜10μmの深さまでエッチングするフューズドシリカ等の酸化が可能なDRIEを用いた。このポリコーティングはエッチング時の摩耗されますので、エッチング処理中に定期的にコーティングの整合性を確認する必要があるかもしれません。ウェハ表面の意図的に特徴のない領域がエッチング時の保護ポリ塗装の裸になっている場合は、表面はほとんどのピットインとなっており、もはや接着に適していません生産の最終ステップインチこのケースでは、ウエハは、ほとんどの場合、もはや実行可能である。 4分のマトリックスアッシャー、100 WのRF電力で清掃してください。 XeF 2エッチング装置（ 図3、ステップ6）を有するポリシリコンを取り除きます。それは、フォトレジスト、ポリコーティングのすべてを削除するには、ステップ1.4と、このステップを数回繰り返す必要があるかもしれません。 その後の取り扱い時にチャネルを保護するために、フォトレジストの新しい〜1μmの層でコートウェーハをスピン。 sandblaster（ 図3、ステップ7）ドリルダイヤモンドひっくり返された、または手動で制御するコンピュータを使用して各チップの入口と出口の穴を開けます。ドリルを使用する場合は、気泡のボンダーを自由に使えるように世話をして、アクアボンド55を使用して、犠牲のガラス板上にウエハを（機能面を下に）マウントします。マイクロ-90クリーニング液でドリルを冷却する。これは、その後使用中にチップを詰まらせるチャネルにこだわるからガラスの小さいビットを保持します。 wを注入するシリンジを用いてDI水でウェーハをリンス各穴にアテル。時間に石鹸水に浸します。表面がきれいになるまで数時間、60℃でPRS 2000でフォトレジストとアクアボンドを削除します。 DI水と温かいせっけん水でウェーハを洗浄します。エッチングされた機能を回避し、注射器で再び各穴を洗浄します。窒素を用いて、真空オーブンで乾燥したウェハは120℃に設定彼らは砂の自由であることを確認し、必要に応じて手順を繰り返し洗浄するために穴を点検します。光学的または機械的な表面形状（ 図3、ステップ8）のいずれかでチャネルの深さを測定します。 クリーンウェーハおよび170μmの厚さの石英ガラスと同等の数が1でメガネを扱っている）ピラニア溶液（1〜2時間は、1.1の手順に従って）、2）RCA 2（午前5時01分01秒DI：塩酸：H 2 0 2 75℃で10分間）溶液に、3）RCA 1溶液（午前5時01分01秒DI：NH 4 OH：75Cで22分間、H 2 0 2））。各ソリューションの間に5分間DI水ですすぎます。 の上部に1つのウェハ機能側を上に置くこのようなガラスの小さなウィンドウのような硬い平らな面の上に置か3月4日クリーンルームワイパーのスタック。少なくとも5分間窒素ガスで十分にウェーハを乾燥させます。カバーガラスで繰り返します。エッジでカバーガラスをピックアップし、洗練された側が下向きにウエハ上に保持され、平坦なエッジを整列されるように反転させる。慎重にウェハ上にカバーガラスをドロップすると、それが解決することができます。アライメントを調整するために水平方向にのみナッジ。ウェーハの中心の1つの指で押し下げます。一つは、ボンディングの前外側に放射し始めるはずです。必要な場合は、ボンディング正面（ 図3、ステップ9）を進めるためにウェハ周囲の他の位置に追加の圧力を適用します。 °C別の1.2時間以上の1100から800からして、室温から℃で3時間で800まで上昇するように設定高温オーブンで密封されたウェーハを配置します。 2時間1100℃に保持し、別の1.5時間かけて室温まで下降。 ウェーハダイシングでダイスは、私に見てndividualチップ（ 図3、ステップ10）。 プロトコルは、UV検出のために必要があるかなり珍しい石英ガラス基板中のチャネルの作製について説明します。しかし、このプロトコルは、唯一のエッチングステップ2を必要とし 、シリコン基板に適応することができます。ガラス（ではなく溶融シリカ）カバーガラスを陽極接合を用いてウェハに接合することができます。 2。チップをマウントおよびロードミキシングチップおよびソリューションを保持するためのマニホールドは、そのようなレキサンまたはプレキシガラス、または温度制御のためのアルミニウム（ 図4を参照）として、プラスチック製することができます。アルミを使用している場合は、ソリューションの貯水池貯水池の塩溶液によってアルミニウムの溶解を防ぐために、パリレンでコーティングする必要があります。全体マニホールド、ソリューション、およびチップの温度は熱電デバイスで制御することができます側面と電子制御装置に搭載された。 チップは、マニに釣り合わせられるO-リング小さいと、チップの中心を明確に光学ビューを可能にする止め輪で固定によって倍。 O-リング溝は、チップにあまり圧力をかけることなく、良好な嵌合を確実にするために標準より浅くなければならない、すなわち、002 O-リングがなければならない0.025 "深い。チップがマウントされると、センターとサイド貯水池にソリューションを追加する、井戸の底に閉じ込められたすべての泡を解放するために世話をして。 このミキサーで使用されているボリュームが小さいので、流れはソリューションの井戸の上に適用された空気圧で制御することができます。 図4は、O-リングによるチップマニホールドの上部に嵌合圧力マニホールドを示しています。圧力マニホールドは、2から80〜PSIからの圧力を維持することができるコンピューター制御の圧力変換器に接続されています。チップは、中央とサイドのチャンネルで等しい圧力が線形流量の約100倍の比を生成するように設計されています。 20 PSIで、出口チャネル内の線流速は〜1メートルです。/ sである。 場所は、倒立顕微鏡でマニホールドと接眼レンズやカメラの出力と混合領域を調べます。マニホールドの上に置かれ、白熱電灯は、十分な光を提供します。ジェット機の表示するには、センターチャンネルに屈折液の染料や高屈折率（すなわち、6 M塩酸グアニジン）を使用します。 センターとサイドのチャンネルで同じ圧力で、ジェット機は、目で見たので、0 PSIにおけるサイドチャネル圧力から始めて、徐々に等しい圧力まで増加することは困難です。片方のチャネルが目詰まりしている場合は、ジェットが終了チャネルの壁のいずれかに対してプッシュされます。目に見える詰まりが表示された場合、それは注射器を使って出口チャネルに圧力または真空を適用することにより、外れている可能性があります。 タンパク質または他の有機材料は、チップを詰まら場合、それは一晩Pirhana溶液に浸漬することによって洗浄することができます。 3。データ収集 図5は、基本的な光学機器のレイアウトを示します。顕微鏡の外側の内部または単にダイクロイックミラーを用いた研究用顕微鏡にコリメートされたレーザビームをもたらす。フォーカスがやや混合領域の近くに接眼レンズやカメラで見ることができるようにレーザーの位置を合わせます。 ミキサー内のタンパク質からの蛍光は、対物によって収集され、ダイクロイックミラーを介して送信される、ピンホール、レンズにより集光と光子カウンターの上に結像される。画像にxとyの圧電スキャナ混合領域（典型的なステップサイズが2μmである）を使用してチップをスキャンします。ジェット機の位置を選択し、垂直チャネルの中心に焦点を見つけるために、xとzでスキャンします。顕微鏡の被写界深度は、チャネルの深さよりもはるかに小さいと流量は、壁の1μm以内を除き、チャネル内で均一である。したがって、観測された蛍光の時間分解能は、主に焦点スポットのサイズによって決まります。 終了チャネル（典型的なステップの内で水平方向にスキャンアイズ〜1ミリ秒ごとに位置（ 図6を参照）を観察、ジェットに沿って100μm刻みで）ジェット全体の0.2μmの、ジェットに沿って2μmである。後の時代をキャプチャするためにジェットに沿って80から90ミクロンで、顕微鏡のステージに移動します。 また、光が入射スリットに光を集中するレンズを使用した後、ダイクロイックミラー分光器とCCDで検出することができます。データ収集がフォトンカウンタ（ポジションごとに1秒）より遅いので、一般的にジェットがフォトンカウンターで最初の撮像された後、ジェットに沿ったポイントは、（ 図7を参照）分光器で測定されます。 フォトンカウンタからのデータは、強度対距離のプロットを作成するために、各位置でのジェットの周囲に3から5ピクセルを加算することによって分析されます。時間が適用された圧力（ 図8を参照）に基づいて計算速度を使用して、距離から計算されます。 分光器からのデータは、いくつかの方法を分析することができます。 FRETのために、channe"ドナー"と"アクセプター"として指定されたlsは、それぞれの合計と近接比E = I A /（I D + I D）を計算する（ 図9を参照）。することができますあるいは、単一の値分解は、そのようなタンパク質の折り畳みとしてトリプトファン発光スペクトルの変化として独立したスペクトル成分対時間、見て実行することができます。 出口チャネル内の距離は、サイドチャネルに印加される圧力から決定一定の流量を使用して、時間に変換することができます。終了チャネルの最初の2μm以内、タンパク質ジェットの流量は100倍〜加速し、その地域の時間は、合理化の有限要素解析（ 図8にプロット倍を生産）で計算する必要があります。速度が一定となり、通常の混合よりもはるかに遅い速度を測定する際に無視することができた後に、この加速は〜1-2μsのオフセットを生成します。 4。代表的な結果 図6は、フォトンカウンターで測定した混合領域における強度の等高線図を示しています。ジェットの外側出口チャネルの背景には、検出器のノイズ·フロアの近くになければならず、一般的に減算されていません。高いバックグラウンドが悪いアライメントやタンパク質がチャネルの壁に付着されていることを示すことがあります。特に混合領域の近くに、よじれたり、曲がって見えるジェットは、ノズルの貧しい人々エッチを示しています。 図7は、時間はAlexa 488とAlexa 647で標識したタンパク質をアシルコエンザイムA-結合蛋白質（ACBP）からスペクトルを解決を示しています。このデータは、背景が暗い電荷とレーザー信号を除去するために減算されています。バックグラウンド信号が0 PSIに設定され、センターチャンネルの圧力で撮影されました。 混合時間は、Trpの蛍光消光bとして混合よりもはるかに高速です迅速な反応を測定することによって測定することができますyはKIまたはNaClの添加により、色素のFRET標識された一本鎖DNAの崩壊。ジェットは、顕微鏡の光学解像度よりも小さいので、ジェットフォームなどの混合領域で大強度の低下があります。この楽器の応答がない溶液条件の変化の制御測定を行うことによって削除することができます。 図8は、N-アセチルトリプトファンアミド蛍光の混合（400 mMのKIに）と非混合実験の比率を示しています。行は、COMSOLシミュレーションからKIの予測濃度を示しています。混合時間は、80％を減少させる濃度の時間として測定されるように、8μsです。 データは500μmの長の出口チャネルに沿って100μmの間隔で収集されているので、データは複数のビューから一緒に貼り付ける必要があります。チップは、顕微鏡ステージによって移動されているこれらのビューの間の信号の小さいオフセット、フォーカスの小さな変化に起因する可能性が、時折あります。ステージを移動することによって、80または90ビューごとにミクロン、これらのオフセットは、重複データを調べることによって除去することができます。通常、データは、少なくとも二つの流量で収集され、データは、任意の信号の変化は、タンパク質の実際の分光変化ではなく、光や流れの影響によるものであることを確認するために結合されています。 図9は、の希釈後のタンパク質のACBPの変化をFRET FRETのため、このデータは、制御実験を必要としない6 Mから0.06 Mに変性剤は、すでに比であり、機器の応答が既に削除されます。 T = 0付近の急激なジャンプは、混合時間内FRETシグナルの急激な変化を表しています。 図1電子顕微鏡で測定した混合領域のレイアウト。 図2タンパク質の折りたたみを研究するために混合流体の模式図。蛋白質、それを展開するために高変性剤に溶解させ、それが〜100倍速く流れるバッファを満たしている混合領域に向かってセンターチャンネルを流下する。層流は、変性剤分子が急速に拡散することができ、そこから狭いジェットへのタンパク質の流れを強制的に実行します。ジェットの出口チャネルを流れるように、タンパク質は、共焦点顕微鏡を用いて高い空間および時間分解能で観察することができます。 図3溶融シリカの製造。 1）プロセスでは、上部および下部表面上に堆積多結晶シリコン層（ポリ）と高度に洗練された500μmの厚さの石英ガラス基板（）で始まり、（b）およびフォトレジスト（c）の層でスピンコーティングした。 2）フォトマスクは、（e）はintを持って来られるウェハ、フォトレジストとOハードコンタクトは、UV光（d）に公開されています。 3）ウェハは、開発浴中に配置され、パターンがフォトレジストで明らかにされています。 4）ウェハはDRIEに配置され、機能は上位ポリコーティングにエッチングされています。フォトレジストを除去する。石英ガラス基板には40μm – 5）ポリは、ウェハを酸化物エッチング装置に配置され、機能が10をエッチングしてマスクとして機能します。 6）ポリコーティングがしてXeF 2エッチングで除去される。 7）ウェハは、熱活性化シーラント（G）、ダウン機能側と裏面からスルーホールダイヤモンドドリルビット（F）abrasivelyドリルで犠牲ガラス板に接着されている。 8）表面プロファイラ（h）は、直接エッチングされた機能の深さを測定します。 9）170μmの厚さの溶融シリカカバースリップのウェーハを直接ウェーハの上面に接着されている。 10）ウェハは個々のマイクロ流体チップにダイシングされています。 3976/3976fig4.jpg "/> 図4。ミキサーマニホールド。マイクロ流体チップは、アルミ削り出しの前面プレートと〜200μLの貯水池の下に4つのO-リングソリューションマニホールドに固定されている。大きな穴は、過剰なUV光は散乱せずに脱出することができマニホールド自体から任意の自家蛍光を阻害すると目で、チップの直接照明を可能にする、直接貼付マイクロ流体チップの混合領域上記マニホールドの中心を通って加工されるアライメントやカメラ。空気マニホールドのシールそれぞれの空気の圧力が外部圧力コントロールボックスを介して制御することができるような貯水池のそれぞれ。 図5光共焦点顕微鏡の模式図。 図6。トリプトファンの等高線プロットマイクロミキサーの蛍光。混合領域は、y軸上の〜90μmであります。 図7。ミキサー内で収集された時間依存蛍光スペクトル。緑と赤の矩形はそれぞれ、ドナーとアクセプターチャネルとして指定された波長を示しています。 図8ヨウ化カリウム（ポイントと右軸）によりトリプトファンの蛍光消光により測定し、有限要素解析（ラインと左軸）によって計算された混合時間。 図9は 、タンパク質の折り畳みACBP中に測定された変化のFRET。 t = 0の近くに急激な上昇は、混合時間内のバースト相を表し、遅い上昇は緩やかなアキュムレータを表しますタンパク質の折り畳みのような構造のる。データは、2つの異なる流量で採取し、異なる時間に測定値の異なる密度につながる、重層した。