In dieser Arbeit erklären wir die Herstellung und Verwendung eines mikrofluidischen Mixer zum Mischen zweier Lösungen in ~ 8 ms. Wir zeigen auch den Einsatz dieser Mischer mit spektroskopischen Nachweis mittels UV-Fluoreszenz-und Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET).
Der Prozess, durch den sich ein Protein faltet seine native Konformation ist äußerst relevant für Biologie und Gesundheit des Menschen aber immer noch wenig verstanden. Ein Grund dafür ist, dass Faltung erfolgt über einen weiten Bereich von Zeitskalen von Nanosekunden bis Sekunden oder länger, je nach dem Protein 1. Konventionelle Stopped-Flow-Mischer erlaubt haben Messung von Faltungskinetik ab etwa 1 ms. Wir haben kürzlich einen Mikrofluidik-Mixer, der Vergällungsmittel ~ 100-fach in ~ 8 ms 2 verdünnt entwickelt. Im Gegensatz zu einem Stopped-Flow-Mixer arbeitet diese Mischer in der Laminar-Flow-Regime, in dem Turbulenzen nicht auftritt. Das Fehlen von Turbulenz ermöglicht eine präzise numerische Simulation aller Strömungen innerhalb des Mischers mit exzellenter Übereinstimmung zu experimentieren 3-4.
Laminar-Flow ist für Reynoldszahlen Re ≤ 100 erreicht. Bei wässrigen Lösungen erfordert diese Geometrien im Mikrometerbereich. Wir verwenden ein hartes Substrat, wie Silizium oder Silizium kondensiertenca, um Kanäle 5-10 &mgr; m breit und 10 um tief (siehe Abbildung 1). Die kleinste Abmessungen, am Eingang zu dem Mischbereich, liegen in der Größenordnung von 1 um in der Größe. Der Chip wird mit einer dünnen Glas-oder Fused-Silica-Deckglas für optische Zugang verschlossen. Typische insgesamt lineare Flussraten sind ca. 1 m / s, was zu Re ~ 10, aber die Protein-Verbrauch beträgt nur ~ 0,5 NL / s oder 1,8 ul / hr. Die Proteinkonzentration wird durch den Nachweis Verfahren: Für Tryptophanfluoreszenz die typische Konzentration 100 pM (1 Trp / Protein) und FRET die typische Konzentration ~ 100 nM.
Der Falzvorgang wird durch schnelle Verdünnung des Denaturierungsmittels von 6 M bis 0,06 M Guanidin-Hydrochlorid eingeleitet. Das Protein in hoher Vergällungsmittel fließt einem zentralen Kanal und ist auf beiden Seiten an der Mischbereich durch Puffer ohne Vergällungsmittel bewegt ~ 100-mal schneller (siehe Abbildung 2) erfüllt. Diese Geometrie bewirkt eine schnelle Verengung des Proteins Fluss in ein engesJet ~ 100 nm breit sind. Die Diffusion der Moleküle Licht Vergällungsmittel ist sehr schnell, während die Diffusion der schweren Protein-Moleküle ist viel langsamer, diffundieren weniger als 1 um in 1 ms. Der Unterschied in der Diffusionskonstante des Denaturierungsmittels und den Protein führt zu einer schnellen Verdünnung des Denaturierungsmittels von dem Protein Strom, wodurch die effektive Konzentration des Denaturierungsmittels in der Umgebung des Proteins. Das Protein Strahl fließt mit einer konstanten Geschwindigkeit entlang der Beobachtungskanal und Fluoreszenz des Proteins während der Faltung beobachtet unter Verwendung eines konfokalen 5 beschrieben.
Eine schnelle Durchmischung war ein Entwicklungsziel für das Gebiet der Proteinfaltung seit vielen Jahren, weil es seit langem anerkannt, dass molekulare Prozesse von Biomolekülen über Zeitskalen von Pikosekunden bis Sekunden auftreten. Konventionelle Stopped-Flow-Mischer haben Totzeiten von 1-5 ms, die vor allem durch Turbulenz ist begrenzt. Turbulente kontinuierlichen Mischern mit Mischzeiten von 30-300 us haben in den vergangenen 15 Jahren von einer kleinen Anzahl von Gruppen entwickelt, sondern erfordern in der Regel hohe Flussraten, um diese zu erreichen Mischzeiten und verwenden daher eine Menge von Probe 6-8.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikrofluidsystemen Mischen Chips schnelle Verdünnung in der laminaren Strömung zu erreichen. Es gibt mehrere Vorteile, die innerhalb dieses Systems, sondern eine primäre ist die Fähigkeit, die gesamte Mischverfahren mit hoher Genauigkeit, die man, um die gemischte Antwort zu modifizieren simulieren. T-Mischer von anderen Gruppen mit einfachen geom entwickeltetries haben Mischzeiten von 100-200 us, die hauptsächlich von der Größe der Kanäle 9-10 wurden beschränkt gezeigt. Durch Skalieren der Größe der Kanäle bis 10 um Ritter verringert die Mischzeit auf ~ 10 us 11. Yao und Bakajin zeigte, dass kleine Veränderungen in der Geometrie können zu erheblichen Verbesserungen in der Mischzeit 4 führen. Zeigten jedoch, dass Arbeit, die Beschleunigung der Vermischung kann auch zu einer langsameren Phasen als auch führen. Das Design in dieser Arbeit verwendet 12-13 ist ein Kompromiss zwischen den beiden besten Entwürfe in Bezug 4, um die langsameren exponentiellen Abfall in Vergällungsmittel Konzentration zu minimieren und auch um die Funktion besser reproduzierbar in DRIE Ätzen.
Es gab einige Kontroversen auf dem Gebiet der ultraschnellen Vermischung über die Definition der Mischzeit. Es ist wichtig, den Unterschied zwischen "Mischzeit" und "tote Zeit" zu erkennen. Die Totzeit wird in einem turbulenten Mischer als die Zeit, während der eine Messung! Definiertt nicht gemacht werden und können in der Tat deutlich länger als die tatsächliche Mischzeit. Es wird üblicherweise erreicht, indem mehrere Messungen eines pseudo-erster Ordnung bimolekularen Reaktion (wie Abschrecken der Tryptophan-Fluoreszenz von N bromosuccinate) bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt. Die beobachteten exponentiellen Abfall angebaut, um an einem einzigen Wert angenommen, dass t = 0 s sein konvergieren und die Zeit zwischen diesem Zeitpunkt und dem ersten Messpunkt ist die Totzeit. Für laminare Strömung Mischer, können die Messungen während des Mischprozesses hergestellt sein, so gibt es keine Totzeit nur eine Mischzeit. Die Mischzeit ist einfach die Zeit, um zwei Lösungen kombinieren, bis eine ausreichende Einheitlichkeit erreicht wird. Wir haben zuvor die Mischzeit auf eine 90/10, die Zeit für die Konzentration des Denaturierungsmittels, um von 90% bis 10% des ungemischten Wert verkleinert werden definiert. Jedoch ist die Form des Mischkurve nicht perfekt symmetrisch mit dem Schwanz des Zerfalls mit einer kleinen exponentielle Komponente. Ferner weist ein Proteinfaltungstark nicht-lineare Abhängigkeit von Denaturierungsmittel Konzentration, so dass Falten oft beginnen kann, selbst wenn der Vergällungsstoff nur durch zwei-fache reduziert. Deshalb haben wir in jüngster Zeit die Mischzeit als die Zeit, um die Vergällungsmittel Konzentration um 80% definiert. Sicherlich andere Definitionen können in Abhängigkeit von den Anforderungen des Experiments werden.
Die Verwendung dieses Mischpult auf die Proteinfaltung zu studieren hat immer wieder überraschende Ergebnisse zeigten. Die Faltung von Cytochrom c und Apomyoglobin haben lange studiert worden, um mehrere Klapptritt und frühen Ergebnisse mit kontinuierlichen Mischern haben gezeigt, Zusammenbruch auf der ~ 100 us Zeitskala 10,14-15 auftreten. Unsere Messungen mit diesem Mixer zeigte dort auf mindestens 2 Schritte auf dieser Zeitskala zu sein, ein sehr schneller, wahrscheinlich nicht-spezifischen, Kollaps (wie von Trp-Fluoreszenz spektrale Verschiebung gemessen) innerhalb der Mischzeit des Mischers eine längere Phase folgte (wie gemessen durch das Abschrecken von insgesamt Trp Emission) das ist wahrscheinlich das first Bildung von nativen Struktur 5. Wir haben auch ein 50 us-Prozess in der B1-Domäne von Protein L beobachtet, Umsturz der herkömmlichen Interpretation, dass dieses Protein eine 2-Staaten-Ordner 13 ist.
Ein Vorteil dieser schnellen Mischer ist, dass es die Faltung von Proteinen zu den am schnellsten Faltung, die normalerweise nur messbar gewesen durch Nanosekunden-T-Sprung Instrumente zu sondieren. T-Sprung erfordert in der Regel Beobachtung der Faltung / Entfaltung Entspannung in der Nähe der Schmelztemperatur des Proteins und somit nie folgt die Faltung der gesamten Bevölkerung. Mit diesem Mischpult haben wir bei der Faltung von γ-Repressor (λ 6-86) sowohl mit Trp Gesamtemission und spektrale Verschiebung angesehen und fand Beweise, dass das Protein kein Hindernis für die Faltung unter Bedingungen, die starke Faltung nicht zugänglich waren zu früheren T hat -Messungen 12 springen. Schließlich haben wir den Falten des Villin Kopfstück HP-35 gemessen, von ter am schnellsten Ordner nicht gemessen und festgestellt, dass die Faltung Rate nach dem Mischen gemessen ~ 5-mal langsamer als mit T-Sprung unter den gleichen Bedingungen 16 gemessen ist. Dies deutet darauf hin, dass Faltungskinetik von den Anfangsbedingungen ab hängt, Kippen eine wichtige Annahme in diesem Bereich.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird von der National Science Foundation FIBR (NSF EF-0623664) und IDBR (NSF DBI-0754570) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise aus Mitteln der National Science Foundation Grants FIBR 0623664 vom Zentrum für Biophotonik, einem NSF Science and Technology Center verwaltet, von der University of California, Davis, unter einem Kooperationsabkommen PHY 0120999 verwaltet unterstützt. Die Forschung von Lisa Lapidus, Ph.D. wird zum Teil durch ein Career Award in der wissenschaftlichen Schnittstelle von der Burroughs Welcome Fonds unterstützt werden.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
Microscope | Olympus | IX-51 | |
Microscope Objective | Thor Labs | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
Microscope Objective | Olympus | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
GaAsP Photon Counter | Hamamatsu | H7421-40 | |
Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
CCD camera | Andor Technology | iDus 420A-BU | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |