في هذا العمل نفسر تصنيع واستخدام خلاط ميكروفلويديك قادرة على خلط نوعين من الحلول في ميكروثانية 8 ~. علينا أن نبرهن أيضا استخدام هذه الخلاطات مع كشف التحليل الطيفي باستخدام مضان الأشعة فوق البنفسجية ومضان نقل الطاقة الرنين (الحنق).
العملية التي يتم من خلالها طيات البروتين في التشكل الأصلي هو ذات أهمية كبيرة لعلم الأحياء والصحة البشرية حتى الآن لا تزال غير مفهومة تماما. وأحد أسباب ذلك هو أن للطي يتم خلال مجموعة واسعة من الجداول الزمنية، من النانو ثانية إلى ثانية أو أكثر، اعتمادا على بروتين 1. وقد سمح التقليدية توقف تدفق خلاطات قياس حركية قابلة للطي ابتداء من الساعة حوالي 1 مللي. وقد وضعنا مؤخرا خالط ميكروفلويديك أن يخفف ممسخ ~ 100 أضعاف في ميكروثانية 8 ~ 2. وخلافا للخلاط توقفت عن التدفق، وهذا خلاط يعمل في نظام تدفق الصفحي في الاضطرابات التي لا تحدث. لعدم وجود اضطراب يسمح محاكاة رقمية دقيقة لجميع التدفقات داخل خلاط مع اتفاق ممتاز لهذه التجربة 3-4.
ويتم تحقيق تدفق رقائقي للأرقام رينولدز إعادة ≤ 100. لالمحاليل المائية، وهذا يتطلب هندستها نطاق ميكرون. نستخدم الركيزة الصلبة، مثل السيليكون أو سيلييه تنصهركاليفورنيا، إلى جعل قنوات 5-10 ميكرون واسعة وعميقة 10 ميكرومتر (انظر الشكل 1). أصغر الأبعاد، عند مدخل المنطقة الاختلاط، وبناء على امر من 1 ميكرومتر في الحجم. وختم رقاقة مع كوب رقيق أو تنصهر السيليكا ساترة للوصول البصرية. نموذجي مجموع معدلات تدفق الخطية هي ~ 1 م / ث، وإعادة الرضوخ ~ 10، ولكن استهلاك البروتين هو فقط ~ 0.5 NL / ثانية أو 1.8 ميكروليتر / ساعة. تركيز بروتين يعتمد على طريقة الكشف: للحصول على مضان التربتوفان تركيز نموذجي هو 100 ميكرون (للفترة من 1 بروتين / الحزب) والحنق تركيز نموذجي هو ~ 100 نانومتر.
وبدأت عملية قابلة للطي من قبل التخفيف السريع للممسخ في الفترة من 6 إلى 0،06 م هيدروكلوريد الجوانيدين M. البروتين في ممسخ ارتفاع تدفقات أسفل القناة المركزية ويتحقق في أي من الجانبين في المنطقة العازلة دون خلط بواسطة ممسخ تتحرك ~ 100 مرات أسرع (انظر الشكل 2). هذه الهندسة يسبب انقباض السريع لتدفق بروتين في ضيقطائرة ~ 100 نانومتر واسعة. انتشار الجزيئات ممسخ ضوء سريع جدا، في حين نشر جزيئات البروتين الثقيلة أبطأ بكثير، نشرها أقل من 1 ميكرومتر في 1 مللي ثانية. الفرق في نشر المستمر للممسخ ونتائج البروتين في تخفيف سريع للممسخ من تيار البروتين، والحد من تركيز الفعال للممسخ حول بروتين. الطائرة بروتين يتدفق بمعدل ثابت باستمرار على قناة المراقبة ومضان من البروتين خلال للطي يمكن ملاحظتها باستخدام مجهر المسح مبائر 5.
كان سريعا خلط هدف التنمية للحقل من طي البروتين لسنوات عديدة بسبب منذ فترة طويلة من المسلم به أن العمليات الجزيئية من الجزيئات الحيوية تحدث على مدى فترات زمنية تتراوح ما بين picoseconds إلى ثواني. التقليدية توقف تدفق خلاطات لها أوقات ميتة من مرض التصلب العصبي المتعدد 1-5 والتي تقتصر في المقام الأول من قبل الاضطرابات. وقد وضعت المضطربة خلاطات التدفق المستمر مع أوقات اختلاط 30-300 ميكرو ثانية على مدى السنوات ال 15 الماضية من قبل عدد قليل من الجماعات لكن عموما تتطلب معدلات تدفق عالية لتحقيق هذه الأوقات خلط وبالتالي استخدام الكثير من عينة 6-8.
هذا البروتوكول يصف استخدام رقائق خلط ميكروفلويديك لتحقيق تخفيف السريع في تدفق رقائقي النظام. هناك مزايا عدة للعمل ضمن هذا النظام، ولكن واحد أساسي هو القدرة على محاكاة عملية خلط كامل مع دقة عالية مما يسمح احد لتعديل استجابة الاختلاط. T-خلاطات التي وضعتها مجموعات أخرى مع GEOM بسيطوقد أثبتت etries مرات خلط 100-200 ميكرو ثانية التي كانت تقتصر في المقام الأول عن طريق حجم قنوات 9-10. عن طريق التوسع في حجم القنوات إلى فارس 10 ميكرومتر تقليل الوقت الاختلاط إلى ميكروثانية 10 ~ 11. وأظهرت ياو وBakajin أن تغييرات صغيرة في الهندسة يمكن أن تؤدي إلى تحسينات كبيرة في زمن الخلط 4. ومع ذلك، أظهرت أن العمل الذي تسارع من الخلط يمكن أن يؤدي أيضا إلى تباطؤ مراحل كذلك. تصميم المستخدمة في هذا العمل 12-13 هو حل وسط بين اثنين من افضل التصاميم في إشارة 4 إلى التقليل من أبطأ الاضمحلال الأسي في تركيز ممسخ وايضا لجعل هذه الميزة أكثر استنساخه في النقش DRIE.
كان هناك بعض الجدل في مجال ultrarapid خلط حول تعريف الوقت الاختلاط. من المهم أن ندرك الفرق بين "زمن الخلط" و "الوقت الميت". ويعرف في الوقت الميت في خلاط المضطرب كما في المرة خلالها measuremenلا يمكن أن يتم تي ويمكن في الواقع أن تكون أطول بكثير من الوقت الذي خلط الفعلية. وعادة ما يتم تحديد ذلك عن طريق جعل قياسات عدة من رد فعل النظام ثنائي الجزيء الزائفة والعشرين (مثل التبريد ومضان التربتوفان بواسطة bromosuccinate N) بتركيزات مختلفة. يتم تركيبها في يضمحل المرصودة الأسي أن تتلاقى في قيمة واحدة يفترض أن تكون = 0 ر ق والوقت بين تلك النقطة والنقطة الأولى هي قياس الوقت الميت. لخلاطات تدفق الصفحي، يمكن إجراء قياسات أثناء عملية الخلط لذلك ليس هناك وقت ميت، سوى وقت الخلط. الوقت هو مجرد خلط الوقت على الجمع بين نوعين من الحلول حتى يتم التوصل إلى توحيد كاف. حددناها سابقا في الوقت الخلط إلى أن يكون الوقت 90/10، والوقت للتركيز ممسخ أن ينخفض من 90٪ إلى 10٪ من قيمة غير مخلوط. ومع ذلك، فإن شكل المنحنى خلط غير متماثل تماما مع الذيل من الاضمحلال وجود عنصر صغير الأسي. وعلاوة على ذلك، طي البروتين لديهغاية غير الخطية والاعتماد على تركيز ممسخ بحيث قابلة للطي يمكن أن تبدأ في كثير من الأحيان حتى لو يتم تقليل فقط ممسخ من قبل اثنين من أمثالها. ولذلك قمنا في الآونة الأخيرة تعريف زمن الخلط والوقت للحد من تركيز ممسخ بنسبة 80٪. يمكن بالتأكيد أن تستخدم تعريفات أخرى تبعا لاحتياجات التجربة.
وكشف استخدام هذا الخلاط لدراسة طي البروتين على الدوام نتائج مذهلة. للطي من ج السيتوكروم وapomyoglobin منذ فترة طويلة ان يكون درس خطوات للطي متعددة والنتائج في وقت مبكر مع خلاطات التدفق المستمر وأظهرت انهيار تحدث على مقياس الوقت ~ 100 ميكرو ثانية 10،14-15. وأظهرت قياسات لدينا مع هذا الخلاط أن يكون هناك ما لا يقل عن 2 خطوات على هذا الجدول الزمني، وهو، على الأرجح بسرعة كبيرة غير محددة، وانهيار (مقاسا التحول مضان الطيفي التربتوفان) في وقت خلط خالط تليها مرحلة أبطأ (كما هو الحال تقاس التبريد من الانبعاثات التربتوفان الكل) أن من المرجح أن FIRST تشكيل هيكل الأصلي 5. وقد لاحظنا أيضا عملية ميكروثانية 50 في نطاق B1 من L بروتين، قلب التفسير التقليدي أن هذا البروتين هو مجلد 2-13 دولة.
ومن مزايا هذا الخلاط السريع هو أنه لا يمكن سبر للطي من البروتينات أسرع للطي والتي عادة ما كانت قابلة للقياس فقط من الصكوك T-الوثب النانوسيكند. T-القفز عادة ما يتطلب مراقبة للطي / تتكشف الاسترخاء بالقرب من درجة حرارة انصهار من البروتين، وبالتالي لم يتبع للطي من مجموع السكان. مع هذا الخلاط لقد ألقينا نظرة على للطي من قامع-γ (λ 6-86) مع كل من اجمالى انبعاثات التربتوفان والتحول الطيفية ولقد وجدت أدلة على أن بروتين لا يوجد لديه حاجز للطي في ظل ظروف قابلة للطي القوية التي لم تكن في متناول تي السابقة -القفز قياسات 12. أخيرا لقد قمنا بقياس قابلة للطي من خوذة villin HP-35، واحدة من رانه أسرع المجلدات تقاس بعد، ووجدت أن نسبة قابلة للطي قياس بعد خلط ~ 5 مرات أبطأ من قياس T-القفزة في ظل نفس الظروف 16. هذا يشير إلى أن حركية قابلة للطي تعتمد على ظروف الانطلاق، في انقلاب افتراض رئيسي في هذا المجال.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم FIBR (جبهة الخلاص الوطني EF-0623664) وIDBR (جبهة الخلاص الوطني DBI-0754570). وأيد هذا العمل جزئيا بتمويل من المنحة الوطنية للعلوم FIBR 0623664 مؤسسة تدار من قبل مركز بيوفوتونيك، وجبهة الخلاص الوطني للعلوم والتكنولوجيا المركز، الذي تديره جامعة كاليفورنيا في ديفيز، في إطار اتفاق التعاون PHY 0120999. البحوث من ليزا لابيدوس، دكتوراه معتمد في جزء من جائزة الوظيفي في واجهة العلم من صندوق مرحبا بوروز.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
Microscope | Olympus | IX-51 | |
Microscope Objective | Thor Labs | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
Microscope Objective | Olympus | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
GaAsP Photon Counter | Hamamatsu | H7421-40 | |
Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
CCD camera | Andor Technology | iDus 420A-BU | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |