1. Подготовка ДНК плазмиды Encapsulated EGFR-целевой Желатин Наночастицы Синтез тиолированного желатина Тиолированного желатина были синтезированы, как предыдущий метод 2-5, ковалентными сопряжения с 2-iminothiolane на первичных аминогрупп типа B желатин. 1 г желатина растворяют в 100 мл деионизированной воды и инкубировали с 20 мг 2-iminothiolane гидрохлорид при комнатной температуре в течение 15 часов. Непрореагировавшего реагента удаляли диализом против 5 мМ HCl раствор, затем по 1 мМ HCl решение для 3-х часов каждая. Очищенная тиолированного желатина сублимированных и хранили при 4 ° C для дальнейшего использования. Подготовка ДНК-содержащих наночастицы 200 мг тиолированного желатин растворяют в воде и рН раствора доводили до 7 добавлением 0,2 М раствора NaOH. 1 мг ДНК была добавлена и осторожно смешать с желатином решение. Охлажденные этанола медленно добавляют в смесь прираствору на высокой скорости. Наночастицы были сформированы, когда состав растворителя изменен на 75% водно-спиртового раствора. Наночастицы были дополнительно сшитого медленным добавлением 0,1 мл 8% (объем / объем) глиоксаля решение. Непрореагировавшие реагентов гасили 0,5 мл 0,2 М раствора глицина. Наночастицы были ультра-центрифугировали при 16000 оборотов в минуту в течение 30 минут. Гранулы промывали деионизованной водой в два раза и очищенный наночастицы лиофилизированной и хранили при температуре 4 ° С. Модификация поверхности наночастиц Наночастицы были приостановлены в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) при концентрации 10 мг / мл и инкубировали с 2 раза вес метокси-PEG-сукцинимидил карбокси метиловый эфир (MPEG-SCM, МВт 2000 Da) или малеимида-ПЭГ-сукцинимидил карбокси метиловый эфир (MAL-PEG-SCM, МВт 2000 Da) в течение 2 часов при комнатной температуре при медленном перемешивании. Пегилированный наночастицы были собраны с ультра-центрифугирования при 16000 оборотов в минуту в течение 30 минутs. Гранулы промывали деионизованной водой в два раза и очищенный наночастицы лиофилизированной и хранили при температуре 4 ° С. MAL-PEG-СКМ изменение наночастицы были приостановлены в 0,1 М фосфатный буфер (рН 6,5) с концентрацией 10mg/ml и инкубировали с 10% веса EGFR конкретного пептида (YHWYGYTPQNVI-GGGGC) в течение 6 часов при комнатной температуре при медленном перемешивании. Пептиды изменение наночастицы были собраны с ультра-центрифугирования при 16000 оборотов в минуту в течение 30 минут. Гранулы промывали деионизованной водой в два раза и очищенный наночастицы лиофилизированной и хранили при температуре 4 ° С. 2. Характеристика EGFR-целевых наночастиц Размер частиц и дзета-потенциал измерения Наночастицы были приостановлены в воде с концентрацией 1mg/ml. Подвеска была проанализирована с помощью Zetasizer Nano (Malvern Inc). Анализ размеров частиц проводилась при рассеянии под углом 90 градусов при 25 °С. Дзета-потенциал был измерен по умолчанию параметры диэлектрической проницаемости, показателя преломления и вязкость воды при температуре 25 ° C. Сканирование электронной микроскопии Лиофилизированный наночастицы были установлены на алюминий крепление образца и распыления покрытый палладием для повышения проводимости и свести к минимуму накопление зарядов. Образцы были получены для морфологии поверхности под Hitachi 4800 автоэмиссии сканирующего электронного микроскопа при 3 кВ. Электрон спектроскоп для химического анализа (ESCA) Лиофилизированные формулировка контроля, пегилированный и пептидные изменение наночастицы были проанализированы ESCA. Она была выполнена в Национальном ESCA и анализа поверхности Центр медико-биологических проблем (NESAC / BIO), Университет штата Вашингтон (Сиэтл, штат Вашингтон). Образцы были помещены в сверхвысоком вакууме и подвергались низкоэнергетических рентгеновских лучей, которые индуцированной эмиссии вторичных фотоэлектронов с поверхности. Построив число зарегистрированных электронов в зависимости от бендинь энергии, наблюдаемые пики спектра были отнесены к каждой химических компонентов. Высокое разрешение анализ C1s спектров была проведена для определения точного химического состава от углеводородных (CC или CH на 285mV), эфир (СО) в 286.4mV), и карбонильных (С = О на 288,1 мВ), и относительный состав каждой функции, определялась площадь под кривой. Стабильность инкапсулированные плазмиды Стабильность инкапсулированных плазмидной ДНК подтвердил, запустив извлеченные ДНК на сборных гелей. Наночастицы были переварены с 0,2 мг / мл протеазы содержащие PBS (30 мин при 37 ° С) и 0,2 Ед / мл ДНКазы (10 мин при комнатной температуре) отдельно, одновременно или последовательно. Образцы затем загружены на 1,2% агарозном геле (GP) (E-гель, Invitrogen, Калифорния) в концентрации 100ng/well в 18μL объема на лунку. Голая плазмиды был загружен, как контроль и геля проводили при 75 В в течение 30 минут. Kodak Digital рентгеновский образца (DXS) система была использована для визуализации бпучки с УФ transluminescence. Определение плазмиды загрузки Плазмиды инкапсулированных наночастиц были приостановлены на 1mg/ml и переваривают 0.2mg/ml протеазы при температуре 37 ° С в течение 30 минут. Решение центрифугировали при 13000 оборотов в минуту в течение 10 минут и супернатант собраны и протестированы на концентрацию плазмиды с Picogreen анализа (Invitrogen). Инкапсуляция Норматив рассчитан путем деления инкапсулированные плазмиды концентрации с начальной загрузки 0,5% (в / в). 3. In Vitro Трансфекция исследований в Panc-1 клетки рака поджелудочной железы Условиях культуры клеток Panc-1 и Capan-1 поджелудочной линии аденокарциномы клетки, SKOV3 яичников линии клеток аденокарциномы и NIH-3T3 мышиной линии клеток фибробластов были получены из АТСС. Panc-1 и NIH-3T3 были выращены с DMEM поставляется с L-глутамин, Пен-стрептококк и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при температуре 37 ° С и 5% CO 2, в то время как Capan-1 требуется DMEM поставляется 20% эмбриональной телячьей сыворотки.SKOV3 был выращен в RPMI-1640 поставляется с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Вестерн-блот анализа для выражения EGFR Сотовые лизаты были собраны с 2 млн. клеток и проанализированы на общую концентрацию белка использованием BCA анализ (Pierce). NIH-3T3 был использован в качестве отрицательного контроля и SKOV3 был использован в качестве положительного контроля для выражения EGFR. 10 мкг общего экстракта белка работать на сборных додецилсульфата натрия-электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) системы на 135V в течение 90 минут. Затем гель был переведен на PVDF мембрану iBlot Сухой Blotting системы (Invitrogen). Мембрана была блокирована с 5% обезжиренного молока в Твин-содержащих трис буфер солевом растворе (TBS-т) в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембранные был вырезан и инкубировали с 1:1000 разбавления первичной кролика бета-актина антителами и 1:1000 разбавления первичных антител кролика EGFR отдельно ночи при 4 ° C. Мембрана была дважды промываютTBS-т и инкубировали с 1:2000 разведения вторичных анти-кролик хрена пероксидаза-сопряженных IgG в TBS-т на 1 час при комнатной температуре. После промывки избыток антител с TBS-т и воды, 4 мл ECL подложки (Pierce, Rockford, IL, США) и инкубировали с мембранами на 5 минут. Хемилюминесцентные полос затем визуализируются использовании Kodak Digital рентгеновский образца (DXS) системы. Жизнеспособность клеток исследования с различными формулировками Panc-1 клетки выращивали в 96-луночных на 10000 клеток на лунку в 200 мкл DMEM дополнены в одночасье. Рост среду заменяли бессывороточной среде, содержащей различные концентрации наночастиц с 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 мг / мл. 1mg/ml PEI, известные цитотоксических полимера катионные, был использован в качестве положительного контроля. Клетки обрабатывали 200 мкл наночастиц в течение 6 часов, а затем заменили 20 мкл МТС реагента и 100 мкл полнойпитательных сред. После сообщению инкубации в течение 3 часов при 37 ° С в 5% CO 2, абсорбцию продукта формазана измеряли при 490nm с Biotek SynergyHT ридер (Winooski, VT). Процентов жизнеспособность клеток была выражена как отношение оптической плотности полимера обработанных клеток по сравнению с отрицательным контролем (0mg/ml), умноженное на 100 и на графике как функцию концентрации полимера. Исследования сотовый торговли Родамина Б изотиоцианат (RBITC) был использован для сопряжения на тиолированного желатина в результате реакции с аминогруппу. После диализа и лиофилизации, RBITC помечены тиолированного желатина используется для приготовления наночастиц. Перед десольватации, 25 мкл PicoGreen смешивали с 1 мг плазмиды в течение 1 минуты и маркированы плазмиды были добавлены в раствор желатина. Различные формулировки были сделаны следующие предыдущего метода. Panc-1 клетки были выращены в 6-луночных содержащие стеклянной крышкой-квитанции с 200000 клеток рэр хорошо. После роста ночь, 2 мл меченых наночастиц лечились в каждую лунку с концентрацией 1mg/ml в бессывороточной среде. После различные моменты времени, от 15 минут до 6 часов, средний был заменен на культуральной среде, содержащей 1μg/ml из Hoest 33342 (Invitrogen) в течение 15 минут инкубации при комнатной температуре. 2 мл 4% параформальдегида решение было заменено в каждую лунку исправить клеток. Затем клетки промывали PBS в два раза. Coversilps были смонтированы на предметных стеклах. Лазерное сканирование конфокальной флуоресцентной микроскопии был использован для получения изображений фиксированных клеток. Качественное определение эффективности трансфекции помощью флуоресцентной микроскопии с pEGFP-N1 инкапсулированных наночастиц pEGFP-N1 плазмиды инкапсулированные в наночастицы и взвешенных в сыворотке крови свободных средств массовой информации с концентрацией эквивалентно 10 мкг на мл плазмиды для дальнейшего лечения. Panc-1 клетки выращивали в течение ночи в 6-луночных contaiНин стеклянной крышкой-квитанции с 200 000 клеток на лунку. 2 мл pEGFP-N1 плазмид наночастиц инкапсулированные лечились в каждую лунку. 20 мкг плазмид были смешаны с 20 мкл липофектина, катионных реагентов трансфекции липидов, и она была использована в качестве положительного контроля, а необработанных клеток были использованы в качестве отрицательного контроля. Клетки инкубировали с различными формулировками в течение 6 часов. Средний был заменен на питательную среду и клетки после трансфекции в течение 24, 48, 72 и 96 часов. После после трансфекции, средний был заменен на культуральной среде, содержащей 1μg/ml из Hoest 33342 (Invitrogen) и инкубировали с клетками в течение 15 минут при комнатной температуре. Покровные стекла были установлены на стеклах и выражения GFP в клетках было обнаружено флуоресцентного микроскопа. Дифференциальная интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентные изображения получены с помощью микроскопа Olympus BX61 и цифровые изображения были обработаны с изображением программного обеспечения J. <li> Количественное определение эффективности трансфекции с помощью ИФА с pEGFP-N1 инкапсулированных наночастиц pEGFP-N1 плазмиды инкапсулированные в наночастицы и взвешенных в сыворотке крови свободных средств массовой информации с концентрацией эквивалентно 10 мкг на мл плазмиды для дальнейшего лечения. Panc-1 клетки выращивали в течение ночи в 6-луночных планшет с 200 000 клеток на лунку. 2 мл pEGFP-N1 плазмид наночастиц инкапсулированные лечились в каждую лунку. 20 мкг плазмид были смешаны с 20 мкл липофектина, катионных реагентов трансфекции липидов, который использовался в качестве положительного контроля и необработанных клеток были использованы в качестве отрицательного контроля. Клетки инкубировали с различными формулировками в течение 6 часов. Средний был заменен на питательную среду и клетки после инкубировали в течение 24, 48, 72 и 96 часов. После после трансфекции, клеточные лизаты были собраны из каждой лунки и проанализированы на общую концентрацию белка использованием BCA анализ (Pierce). луночного планшета была соаТед с 100 мкл 1:1000 разведения моноклональных анти-GFP антител в каждую лунку. После инкубации 2 часа, пластины промывали PBS-0,5% (м / о) Твин-80 в 4 раза. 300 мкл TBS блокировки буфера были добавлены в каждую лунку и инкубировали в течение 2 часов. Затем пластину промывали PBS-0,5% (м / о) Твин-80 в 4 раза. 30μg белков каждой группы были добавлены в пластину и инкубировали в течение ночи при 4 °. Затем пластину промывали PBS-0,5% (м / о) Твин-80 в 4 раза. 100 мкл разведения 1:2400 вторичных анти-GFP антитела по отношению к щелочной фосфатазы были добавлены в каждую лунку и инкубировали в течение 1 часа. Затем пластину промывали PBS-0,5% (м / о) Твин-80 в 4 раза. 100 мкл щелочной фосфатазы субстратов добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут до 1 часа. Пластина была измерена с Biotek Synergy HT ридер по поглощению при 405 нм. Выраженный GFP концентрация была отмечена как нанограмм на миlligrams общего белка. Качественное определение эффективности трансфекции ОТ-ПЦР с мас-плазмиды р53 инкапсулированных наночастиц Вес-р53 плазмиды инкапсулированные в наночастицы и взвешенных в сыворотке крови свободных средств массовой информации с концентрацией эквивалентно 10 мкг на мл плазмиды для дальнейшего лечения. Panc-1 клетки выращивали в течение ночи в 6-луночных планшет с 200 000 клеток на лунку. 2 мл мас-плазмиды р53 инкапсулированных наночастиц лечились в каждую лунку. 20 мкг плазмид были смешаны с 20 мкл липофектина, катионных реагентов трансфекции липидов, который использовался в качестве положительного контроля и необработанных клеток были использованы в качестве отрицательного контроля. Клетки инкубировали с различными формулировками в течение 6 часов. Средний был заменен на питательную среду и клетки после инкубировали в течение 48 часов. мРНК были извлечены из каждой лунки с помощью особо чистых РНК изоляции комплект (Roche, Indianapolis, IN) и измеряется с Nanodrop 2000 (Thermo Научные, Wilminton, DE). RT-PCR было сделано с помощью QIAGEN один шаг ОТ-ПЦР комплект (QIAGEN, Валенсия, Калифорния). Грунтовки для р53, Bax, Bcl-2, бета-актина, DR5, Apaf-1, PUMA, сурвивина были синтезированы Eurofins MWG Оперон (Хантсвилле, Алабама). ПЦР-продукты были оценены с помощью гель-электрофореза и пикселей кДНК полосы были проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ. Количественное определение терапевтической эффективности с мас-p53 palsmid инкапсулированных наночастиц Вес-р53 плазмиды инкапсулированные в наночастицы и взвешенных в сыворотке крови свободных средств массовой информации с концентрацией эквивалентно 10 мкг на мл плазмиды для дальнейшего лечения. Panc-1 клетки выращивали в течение ночи в 6-луночных планшет с 200 000 клеток на лунку. 2 мл мас-плазмиды р53 инкапсулированных наночастиц лечились в каждую лунку. 20 мкг плазмид были смешаны с 20 мкл липофектина, катионных реагентов трансфекции липидов, который использовался в качестве положительного контроля и необработанных клеткахиспользуется в качестве отрицательного контроля. Клетки инкубировали с различными формулировками в течение 6 часов. Средний был заменен на питательную среду и клетки после инкубировали в течение 24, 48, 72 и 96 часов. Конденсации хроматина / проницаемость мембран / Dead Kit апоптоза клеток (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) был использован для обозначения апоптоза клетки, отмершие клетки и живые клетки с различными красителями. iCys исследований изображений Цитометр от CompuCyte (Westwood, Массачусетс) был использован для анализа и сравнения уровня апоптоза после лечения. На основе флуоресценции микроскопических изображений, интенсивности всех цветов был записан и построены по сравнению с графов и проценты для различных групп населения были рассчитаны. По сравнению с отрицательным контролем, а значит не было никакого лечения для клеток, апоптоза клеток раз изменения были рассчитаны, и перечисленных в график. 3.8.8 Апо-ONE Однородная каспазы-3 / 7 Пробирной комплект (Promega, Madison, WI) был использован для изучения рро-апоптотических деятельность после трансфекции мас-р53 плазмиды. 1mg/ml PEI была использована в качестве отрицательного контроля в целях ликвидации всех апоптоза деятельности. После после трансфекции, клетки обрабатывали родамин 110, бис-(N-CBZL-аспартил-L-глутамил-L-валил-L-аспарагиновой кислоты амида; Z-DEVD-R110), который является субстратом каспазы 3 / 7, в течение 18 часов. Пластина была измерена с Biotek Synergy HT ридер для флуоресценции при 490/520 нм. На основе интенсивности флуоресценции зеленых, проапоптическую деятельности может быть оценена. 4. Представитель Результаты 1. Синтез и Chatacterization из EGFR целевых наночастиц EGFR ориентации пептида модифицированные наночастицы были синтезированы, как и схема показали на рисунке 1. Наночастиц подготовленный десольватации были характерны для размера частиц и дзета-потенциал. Средний заряд размер и поверхность частиц, полученных из тиолированного желатиныс разной степенью thiolation приведены в таблице 1. Средний диаметр частиц различных наночастиц между 150-250 нм. Тиолированного наночастицы имеют меньшие размеры по сравнению с желатином наночастиц, может за счет образования дисульфидных мостов внутри частиц. С различными модификациями поверхности, размеры наночастиц возросли. Дзета-потенциалы различных формулировок было около -20 мВ. При анализе СЭМ, размеры, морфологию поверхности и сферическая форма наночастиц наблюдались и соответствующие Zetasizer результат. ДНК загрузке эффективность в желатиновые наночастицы и тиолированного желатин наночастицы были выше, чем на 95% (табл. 1). Рисунок 1. Химической реакции Схема, иллюстрирующая модификации поверхности наночастиц тиолированного желатин с эпидермального роста фактоГ-рецепторов (EGFR), обязательные пептида через поли (этиленгликоля) (ПЭГ) распорки. Характеристика Наночастицы Формулирование Диаметр наночастиц (нм) Зета потенциал (мВ) Эффективность Загрузка плазмидой ДНК (%) Гель Н.П. 151,4 ± 23,5 -17,1 ± 5,23 95,6 ± 2,2 SH-гель Н.П. 132,6 ± 17,9 -24,6 ± 5,16 97,0 ± 3,8 SH-гель-ПЭГ 179,0 ± 30,9 -22,3 ± 9,50 95,8 ± 6,5 SH-гель ПЭГ пептид 230,8 ± 41,5 -18,1 ± 4,02 94,8 ± 5,1 ТаBLE 1. Размер частиц, поверхностный заряд, и плазмидной ДНК инкапсуляции эффективность контроля и EGFR-целевых желатина и желатин тиолированного наночастиц. Высокое разрешение C 1S сканирование электронной спектроскопии для химического анализа (ESCA) была использована для анализа поверхности компонент тиолированного желатин (SH-гель NP), ПЭГ-модифицированный тиолированного желатин (SH-гель ПЭГ) и EGFR ориентации пептид-модифицированный желатин тиолированного наночастиц (SH-гель ПЭГ пептид). Результаты в таблице 2, показал, пик интенсивности СН (углеводородов), CO (эфир), и С = О (карбонил) групп на 285,0, 286,3 и 288,1 эВ соответственно. Сигнал эфир СО усилилась после PEG изменения и снизилась после пептид сопряжения. Хотя состав азота снизился после PEG модификации и возросла после пептид модификация, которая подтвердила наличие EGFR-таргетинга пептида на наночастицах. ЭСХА еще раз подтвердил ПЭГ и пептидные модификации поверхности. Электронной спектроскопии для химического анализа состава поверхности наночастиц Формулирование С 1s (%) О 1s (%) N 1 с (%) SH-гель Н.П. 59,3 ± 0,8 22,9 ± 0,5 12,9 ± 0,1 SH-гель-ПЭГ 58,2 ± 0,6 28,0 ± 1,2 9,5 ± 0,7 SH-гель ПЭГ пептид 56,7 ± 0,8 25,9 ± 0,7 12,3 ± 0,6 Формулирование CC (%) CO, N (%) C = O (% ) SH-гель Н.П. 51,5 26,6 21,9 SH-гель-ПЭГ 17,1 63,1 19,8 SH-гель ПЭГ пептид 33,1 42,8 24,1 Таблица 2. C 1S с высоким разрешением сканирования электронной спектроскопии для химического анализа (ESCA) Для того, чтобы исследовать стабильность инкапсулированных плазмиды, наночастицы лечили протеазы или ДНКазы отдельно, simuntaneously или последовательно. После электрофореза результаты на рисунке 2 показано, что ДНК плазмиды инкапсулируются во всех наночастицы защищена наночастиц и стабильной, сравнимых с голой ДНК плазмиды. Эти изучал показали, что все эти наночастицы могут инкапсулировать и сохранение плазмиды структуры после инкапсуляции. / Files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/> Рисунок 2. Стабильность ДНК плазмиды инкапсулированных в тиолированного желатин, ПЭГ-модифицированный тиолированного желатин и EGFR пептид-модифицированный желатин тиолированного наночастиц с помощью электрофореза в агарозном геле. Наночастиц лечились 0,2 мг / мл протеазы доказать плазмиды инкапсуляции ДНК в наночастицы матрицы 2. Базовый EGFR Выражение в клетках рака поджелудочной железы Два человека поджелудочной железы аденокарцинома клеточных линий (Panc-1 и Capan-1) были проанализированы иммуноблоттинг для EGFR выражения. Человек аденокарциномы яичников (SKOV3) и мышиных фибробластов ((NIH-3T3) клеток были выбраны в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно. Бета-актина было проанализировано, как белок контроля нагрузки. Panc-1 клеток показали более высокую EGFR выражении по сравнению с Capan-1 и эта клеточная линия была затем использована для следующих в лабораторных исследованиях 3. Цитотоксичность управления и Surfaсе-Modified тиолированного Желатин Наночастицы Для того чтобы оценить сотовой взаимодействия наночастиц, цитотоксичности проводилось после лечения с помощью наночастиц. По результатам на рисунке 3, и контроль, и с модифицированной поверхностью наночастицы были относительно безопасны и биосовместимых в Panc-1 клеток, даже при высоких концентрациях, при сравнении с PEI. Следующие исследования проводились с 1mg/ml наночастиц. Рисунок 3. Процент выживаемости клеток в зависимости от концентрации наночастиц состава в Panc-1 клетки, как оценивается тетразолия красителя (МТС) анализ 4. Рецептор опосредованного сотовый Поглощение в Panc-1 клетки Чтобы убедиться в доступности поверхности EGFR-таргетинга пептида и рецептор-опосредованных внутриклеточных поглощения наночастиц, система была разработана, маркируя каждую сотрудничестваmponent с различными флуоресценции для визуализации наночастиц поглощения и торговли в клетках. С помощью этой системы маркировки, плазмидной ДНК, наночастицы и ядра клетки могут быть определены. Лазерное сканирование конфокальной флуоресцентной микроскопии был использован для получения изображений в различные моменты времени, от 15 минут до 6 часов. Сравнивая изображения различных формулировках, пептид сопряженные желатин наночастицы показали быстрое поглощение и плазмиды освобождение в течение 30 минут. Этот результат того доказывается, что EGFR пептид-сопряженных наночастиц прошли способствовало эндоцитоза быстрого взаимодействия между EGFR конкретного пептида и EGFR рецепторами на поверхности клетки, который был намного быстрее, по сравнению с другими наночастицами, которые прошли неспецифические эндоцитоза. Исследование сотовый торговли Рисунок 4. Конфокальной флуоресцентной микроскопииalysis ДНК-инкапсулированных поглощения наночастиц и торговли Panc-1 клеток. (Красный = родамина меченных наночастицами, зеленый = PicoGreen меченых ДНК плазмиды, и синий = DAPI меченные ядра). Мощность лазера был в 7 раз меньше в последние четыре цифры нижней панели. 5. Качественный и количественный In Vitro Трансфекция с увеличенной зеленый флуоресцентный белок ИФА на рисунке 5 и флуоресценции микроскопического анализа на рисунке 6, были использованы для измерения качественных и количественных эффективности GFP tranfection в Panc-1 клетки при введении немодифицированных, ПЭГ-модифицированный и EGFR пептид-модифицированный желатин тиолированного наночастиц. Плазмиды выступил EGFR-целевых наночастиц в результате высокого уровня экспрессии GFP после 48 часов по отношению к другим элементам управления, в том числе липофектина-комплекс ДНК. Рисунок 5. GFP выраженияnalyzed методом ИФА на графике как функцию времени после администрацией плазмидной ДНК в контроле и EGFR-целевых наночастиц. Флуоресценции микроскопического анализа для трансфекции GFP Рисунок 6. Качественный анализ зеленого флуоресцентного белка в выражении Panc-1 клеток epifluoresence микроскопии после 24, 48, 72 и 96 часов после трансфекции с EGFP-N1. Липофектина-ДНК комплекс был использован в качестве положительного контроля. 6. In Vitro Tranfection с вирусом дикого типа р53 плазмиды в Panc-1 клетки Дикого типа р53 плазмиды НОРС-hp53 с EF-1α / HTLV гибридных промоутер были извлечены из E. палочки и заключены в наночастицы для изучения апоптоза терапевтический эффект. Panc-1 клетки обрабатывали частиц в течение 6 часов и после трансфекции дополнительных 24, 48, 72 и 96 часов. Так как p53 может индуцировать апоптоз в клетках и для того, чтобы выполнить эту функцию, много ниже по течению транскрипционные факторы будут участвовать и напрямую регулируется выражение мас-р53. Среди них, Bax, каспазы-3, каспазы-9, DR5, PUMA и Apaf-1 будет до регулируемой экспрессией р53 и в то время как Bcl-2, сурвивина бы вниз регулируется. С целью изучения уровня этих факторов транскрипции, мРНК была извлечена из Panc-1 клетки через 48 часов после трансфекции и используется для ОТ-ПЦР. Продукты были оценены с помощью гель-электрофореза и групп были проанализированы с ImageJ. На основании полученных результатов показал, на рисунке 7, сурвивина значительно снизилась при лечении EGFR целевых тиолированного желатин наночастиц по сравнению с другими методами лечения, никаких очевидных изменений был замечен в Bcl-2, Bax и выражение каспазы-3, каспазы-9, DR5, PUMA и Apaf-1increased с целенаправленного лечения наночастицы. les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/> Рисунок 7. МРНК уровни вниз по течению факторов мас-экспрессии p53 сравнивались с помощью ОТ-ПЦР через 48 часа после трансфекции. После мас-p53 трансфекции, конденсации хроматина / проницаемость мембран / Dead комплект Сотовые Апоптоз используется для дифференциации апоптоза клетки, отмершие клетки и живые клетки с различными красителями. iCys исследований изображений Цитометр от CompuCyte (Westwood, Массачусетс) был использован для анализа и сравнения уровня апоптоза после лечения. По сравнению с отрицательным контролем, апоптотических клеток раз изменения были рассчитаны, и перечисленных на рисунке 8. EGFR целевых тиолированного желатин nanopaticles показали высокий апоптоза популяции клеток после после трансфекции. Анализ каспазы 3 / 7 деятельности также показал, что EGFR-целевых наночастиц была быстрой интернализации и высокий уровень апоптоза деятельности в Panc-1 клеток. <img alt="Рисунок 8" src="/files/ftp_upload/3612/3612fig8.jpg" /> Рисунок 8. Цитометрии анализа проапоптическую деятельности в управлении мас-p53 трансфицированных Panc-1 клеток с использованием iCys ° изображений Цитометр