Descrevemos uma abordagem alternativa para a enumeração de micobactérias<em> In vitro</em>, Que usa repórter gene-tagged micobactérias em vez de unidades formadoras de colônia (UFC). "Survival" de organismos, bem como anfitrião-resposta marcadores são medidos simultaneamente, proporcionando um sistema de baixo custo, versátil e funcional para os estudos de host / patógeno interações no contexto da tuberculose.
Ensaios funcionais há muito tempo desempenhou um papel fundamental na medição da imunogenicidade de uma vacina dada. Este é convencionalmente expressa como soro títulos bactericida. Estudos de soro títulos bactericida em resposta a vacinas infantis nos permitiram desenvolver e validar níveis de corte para respostas imunes protetoras e tal cut-offs estão em uso rotineiro. Sem tais ensaios foram levadas adiante na avaliação de rotina de vacinas que induzem principalmente a imunidade mediada por células em forma de respostas de células T efetoras, tais como vacinas contra a tuberculose. No modelo animal, o desempenho de um candidato a vacina dada é rotineiramente avaliada em ensaios padronizados bactericida, e todos os atuais romance TB vacina candidatos foram submetidos a esta etapa na sua avaliação antes da fase 1 de testes em humanos. A avaliação da imunogenicidade e, portanto, a probabilidade de eficácia protectora do romance de vacinas anti-TB deve idealmente submetidos a uma avaliação por etapas semelhantes nos modelos humanos agora, incluindo medidas em ensaios bactericida.
Ensaios bactericida no contexto da pesquisa vacina contra a tuberculose já estão bem estabelecidos em modelos animais, onde eles são aplicados a tela de vacinas candidatas potencialmente promissoras. Redução da carga bacteriana em várias funções órgãos como a principal leitura de imunogenicidade. No entanto, nenhum de tais ensaios foram incorporados ensaios clínicos para novos medicamentos anti-TB vacinas até o momento.
Embora ainda haja incerteza sobre os mecanismos exatos que levam à morte de micobactérias no interior dos macrófagos humanos, a interação de macrófagos e células T com micobactérias é claramente necessária. O ensaio descrito neste trabalho representa uma geração nova de ensaios bactericida que permite estudos de tal chave componentes celulares com todos os outros fatores celular e humoral presentes no sangue inteiro sem fazer suposições sobre sua contribuição relativa individual. O ensaio descrito pelo nosso grupo utiliza pequenos volumes de sangue total e já foi empregada em estudos com adultos e crianças em TB endêmica configurações. Nós mostramos imunogenicidade da vacina BCG, aumento do crescimento de micobactérias em pacientes HIV-positivos, bem como o efeito da terapia anti-retroviral e vitamina D sobre a sobrevivência de micobactérias in vitro. Aqui resumimos a metodologia e apresentar os nossos dados de reprodutibilidade usando este modelo relativamente simples, de baixo custo e de campo-friendly.
Nota: Definições / Abreviaturas
BCG lux = M. bovis BCG, cepa Montreal, transformada com pSMT1 shuttle plasmídeo carregando a genes de Vibrio harveyi luxAB, sob o controle do GroEL micobactérias (Hsp60) promotor.
UFC = Unidade Colony Forming (uma medida de viabilidade de micobactérias).
Ensaios bactericida no contexto da pesquisa vacina contra a tuberculose estão bem estabelecidos em modelos animais, onde são aplicados para a tela vacinas candidatas potencialmente promissoras. Redução da carga bacteriana em várias funções órgãos como a principal leitura de imunogenicidade.
A primeira geração de humanos ensaios bactericida foram projetados usando macrófagos sozinho, infectados com M. tuberculose. CFU serviu como a principal leitura de sobrevivência de m…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por bolsas pessoal do Wellcome Trust para Beate Kampmann (056.608, GRO77273).
Reagent | Company | Cat No |
BCG lux | Various | n/a |
Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
Sterile PBS | In House | n/a |
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
Sterile distilled Water | In House | n/a |
Equipment | ||
Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
10ml pipettes and pipette boy | any | |
1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
General laboratory equipment: | ||
Class II safety cabinet cabinet | ||
Refrigerator (4°C) | ||
Centrifuge | ||
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |