Um modelo atraente para estudar a diferenciação das células-tronco dentro de um animal vivo é o platelminto planária. Regeneração é estudado por experimentos amputação simples que são facilmente realizados em um laboratório básico e são passíveis de (farmacológicos e genéticos<em> In vivo</em> RNAi) manipulação, conforme detalhado por protocolos neste artigo.
Platelmintos de vida livre planária tem uma longa história de uso experimental, devido às suas notáveis capacidades regenerativas 1. Pequenos fragmentos retirados de estes animais reformar o plano de corpo original após a regeneração das estruturas do corpo faltando. Por exemplo, se um fragmento "tronco" é cortado a partir de um verme intacta, 'cabeça' de um novo vai gerar anteriormente e um 'rabo' vai gerar posteriormente restaurar o original polaridade "head-to-tail" das estruturas do corpo antes da amputação (Figura 1A).
Regeneração é impulsionado por células-tronco em planárias, conhecido como "neoblasts 'que se diferenciam em ~ 30 diferentes tipos de células durante a homeostase corporal normal e regeneração de tecidos aplicadas. Este processo regenerativo é robusto e fácil de demonstrar. Devido à dedicação de vários laboratórios pioneiros, muitas ferramentas e métodos genéticos funcionais já foram otimizados para o sistema modelo. Conseqüentemente, os progressos recentes considerável tem sido feito na compreensão e manipulação dos eventos moleculares subjacentes à plasticidade do desenvolvimento planária 2-9.
O sistema modelo planária serão de interesse para uma ampla gama de cientistas. Para os neurocientistas, o modelo oferece a oportunidade de estudar a regeneração de todo um sistema nervoso, ao invés de simplesmente a regeneração / reparação de processo único de células nervosas que normalmente são foco de estudo em muitos modelos estabelecidos. Planárias expressar uma infinidade de neurotransmissores 10, representam um importante sistema para o estudo da evolução do sistema nervoso central 11, 12 e têm potencial de triagem comportamental 13, 14.
Regenerativa resultados são passíveis de manipulação por apparoaches farmacológicos e genéticos. Por exemplo, as drogas podem ser rastreados para efeitos sobre a regeneração simplesmente colocando fragmentos do corpo em soluções contendo droga em diferentes momentos após a amputação. O papel de genes individuais pode ser estudada usando métodos knockdown (in vivo RNAi), que pode ser conseguido através de ciclos de microinjeção ou alimentando-bacterially expressa constrói dsRNA 8, 9, 15. Ambas as abordagens podem produzir fenótipos visualmente impressionante em alta penetrância, por exemplo, regeneração de animais bipolar 16-21. Para facilitar a adoção deste modelo e implementação de tais métodos, nós apresentamos neste artigo vídeo protocolos para ensaios farmacológicos e genéticos (RNAi in vivo pela alimentação), utilizando o planária Dugesia japonica.
Os protocolos descritos aqui detalhadamente os ensaios para o estudo e manipulação de regeneração da planária Dugesia japonica. Eles são simples e não requerem equipamento especializado de modo que possam ser facilmente realizado no laboratório ou sala de aula. Ensaios podem ser realizados individualmente ou combinados (químicos para rastreamento genético de eficácias de drogas in vivo) e pode ser realizada ao nível de genes candidatos, ou são adaptáveis a throughput screening imparcial, acima de 8. Se para o estudo da biologia de planárias intrigante em seu próprio direito, ou para a avaliação in vivo em função de homólogos mamíferos em um modelo alternativo para estudar a regeneração do tecido, estas abordagens devem catalisar o interesse de uma gama diversificada de pesquisadores.
The authors have nothing to disclose.
Trabalho no laboratório é apoiado pela NSF (MCB0919933) e NIH (GM088790).
Reagent | Vendor | Catalogue Number | コメント |
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Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple vendors | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
Plastic tub: Ziploc Twist ‘n Loc (16oz). | Various retailers | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
Hand Blender | Any kitchen supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
Wire 1mm Mesh strainer | Any kitchen supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
Circular filter papers | Whatman #3 | 1003 055 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
Sterile, surgical blades | Multiple Vendors | n/a | |
±Praziquantel | Sigma Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |