概要

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -</sup p53의 - / -</sup 마우스

Published: April 03, 2011
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概要

이 비디오에서는 마우스 thymic 림프종 세포 라인을 확립 프로토콜을 보여줍니다. 및 p53의 – / – – thymic 림프종과 생쥐이 프로토콜에 따라, 우리는 성공적으로 여러 ATM – /에서 T – 세포 라인을 설립했습니다.

Abstract

설립 세포 라인은 연구 실험 동물의 사용을 줄일 수있는 중요한 연구 도구입니다. 특정 같은 ATM과 같은 유전자 변형 생쥐의 변종 – / -와 p53의 – /이 – 일관되게 일찍 삶 1,2에서 thymic 림프종을 개발하고, 따라서, murine T – 세포 라인의 유도를위한 신뢰할 수있는 소스로 검색할 수 있습니다. 여기는 이전의 프로토콜 1,3에서 설명한 interleukins를 추가할 필요없이 설립 murine thymic T – 세포 림프종 라인의 개발을위한 세부적인 프로토콜을 제시한다. 종양은 hunched 자세의 관찰을 바탕으로 눈에 보이는 종양의 초기 표시에서 3~6개월 세 생쥐에서 수확 호흡, 가난한 정리하고 민감한 스트레인 1,4의 낭비를 보람 있었다. / – – [FVB/N- ATM tm1Led / J] 2 p53의 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 쥐가 우리는 성공적으로이 프로토콜을 사용하여 여러 개의 T – 세포 라인과 ATM의 근친 변종을 설립했습니다. 우리는 더 이상 기존 T – 세포 인구의 90 % 이상이 인 경우에는 3 번 CD, CD4와 CD8을 표현 것을 보여줍니다. 안정 설립 세포 라인과 일치, 현재 프로토콜을 사용하여 발생하는 T – 세포는 일년 이상 passaged되었습니다.

Protocol

1. 종양의 해부 종양 절개 들어, 깨끗한 종이 타월이나 일회용 외과 드레이프는 해부 패드에 위치하고 있으며 70 %의 에탄올로 뿌렸어요. 이 프로토콜에 대한 생쥐가 일상적으로 CO 2 euthanized 있습니다. 절개 패드에 euthanized 마우스를 놓고 에탄올과 동물의 양쪽을 스프레이. 마우스는 다리를 통해 삽입 70 % 에탄올로 철저하게 뿌려놓은 4 개 이상의 푸시 핀을 사용하여 절개 패?…

Discussion

이 프로토콜에서는, 우리는 두 개의 다른 마우스 genotypes에서 murine T – 세포 라인을 확립하기위한 자세한 절차를 제공한다 – / – [FVB/N- ATM tm1Led / J]와 p53의 – / – ATM [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . / – – 세 (5 시도 아웃) p53의 – / -이 프로토콜, 6 총 (7 시도 아웃) ATM을 사용하여 murine T – 세포 라인은 우리 연구실에서 설…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 도움이 토론을 위해 컬럼비아 대학에서 미생물학과 면역학의학과에서 박사 보리스 Reizis 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 유동세포계측법 및 비디오 편집과 지원 루 후앙과 기술 지원에 대한 동물용 의약품의 대학, 코넬 대학에서 미생물학과 면역학의학과에서 박사 마가렛 바이노 박사 로드먼 겟첼 및 Deequa Mahamed 감사하고 싶습니다. / – – 생쥐 저자는 또한 p53의를 사육 및 genotyping에 대한 와이즈 실험실에서 자신의 중요한 원고와 비디오 제작의 검토, 그리고 스테파니 Yazinski에 대한 듀하멜 와이즈 실험실의 구성원을 감사하고 싶습니다. 동물 실험은 코넬 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 이 연구는 농업의 미국학과, 협동 상태 연구, 교육 및 연장 서비스, 동물 건강 및 질병 연구 프로그램 (검정 고시 및 RSW)을하고 NIH 보조금 R03 HD058220 및 R01CA108773 (RSW)을 제공한 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. 비디오 듀하멜 & 와이즈 연구소의 인력에 의해 자체 시설을 사용하여 제작되었습니다.

Materials

  • Ice bucket
  • 70% ethanol
  • Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
  • Two sets of small sterile scissors and forceps
  • Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
  • Sterile 18 gauge needles
  • 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
  • 10% buffered formalin
  • Tissue culture flasks
    • T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
    • T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
  • 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
  • Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
  • Culture medium
    • RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
      • 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
      • 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
      • 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
      • 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
  • Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
  • Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
    • anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
    • anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
    • anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
  • Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
  • Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
  • 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)

参考文献

  1. Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
  2. Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
  3. Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
  4. Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
  5. Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
  6. Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
  7. Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
  8. Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).

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記事を引用
Jinadasa, R., Balmus, G., Gerwitz, L., Roden, J., Weiss, R., Duhamel, G. Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice. J. Vis. Exp. (50), e2598, doi:10.3791/2598 (2011).

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