概要

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Published: February 18, 2011
doi:

概要

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Abstract

Imaging is een waardevolle techniek die gebruikt kan worden om biologische processen te controleren. In het bijzonder, kan de aanwezigheid van kankercellen, stamcellen, specifieke immuun soorten cellen, virale pathogenen, parasieten en bacteriën worden gevolgd in real-time in levende dieren 1-2. Toepassing van de bioluminescentie beeldvorming aan de studie van pathogenen heeft voordelen ten opzichte van conventionele strategieën voor de analyse van infecties in diermodellen 3-4. Infecties kunnen gevisualiseerd worden binnen individuele dieren na verloop van tijd, zonder dat euthanasie op de locatie en hoeveelheid van de ziekteverwekker te bepalen. Optische beeldvorming maakt uitgebreid onderzoek van alle weefsels en organen, in plaats van bemonstering van de sites die eerder bekend te zijn besmet. Daarnaast kan de nauwkeurigheid van de enting in specifieke weefsels direct worden bepaald voor de verdere uitvoering van dieren die zonder succes werden ingeënt in het hele experiment. Variabiliteit tussen de dieren kunnen worden gecontroleerd voor, omdat imaging maakt het mogelijk elk dier afzonderlijk worden gevolgd. Imaging heeft het potentieel om grote behoefte aantal dieren te verminderen vanwege de mogelijkheid om gegevens uit tal van tijd punten te verkrijgen zonder dat u afgenomen weefsels te bepalen pathogeen laden 3-4.

Dit protocol beschrijft methoden om infecties in levende dieren met behulp van bioluminescentie beeldvorming voor recombinante stammen van bacteriën te drukken luciferase te visualiseren. De klik kever (CBRLuc) en vuurvlieg luciferases (FFluc) gebruiken luciferine als een substraat 5-6. Het licht geproduceerd door zowel CBRluc en FFluc heeft een breed golflengte van 500 nm tot 700 nm, waardoor deze luciferases uitstekende verslaggevers voor de optische beeldvorming in het leven diermodellen 7-9. Dit komt vooral doordat golflengten van het licht groter is dan 600 nm zijn verplicht om absorptie te voorkomen door hemoglobine, en dus efficiënt reizen door weefsel van zoogdieren. Luciferase is genetisch ingebracht in de bacteriën om te lichtsignaal 10 te produceren. Muizen worden pulmonale geënt met bacteriën bioluminescente intratracheaal de monitoring van infecties in real time mogelijk te maken. Na luciferine injectie, worden de beelden verkregen met behulp van de IVIS Imaging System. Tijdens de beeldvorming, muizen verdoofd met isofluraan met behulp van een XGI-8 Gas Anethesia System. Beelden kunnen worden geanalyseerd om te lokaliseren en het signaal bron, die de bacteriële infectie site (s) en het nummer staat voor respectievelijk kwantificeren. Na de beeldvorming, is CFU bepaling uitgevoerd op gehomogeniseerd weefsel om de aanwezigheid van bacteriën te bevestigen. Meerdere doses van bacteriën worden gebruikt om bacteriële aantallen correleren met luminescentie. Beeldvorming kan worden toegepast op studie van de pathogenese en de evaluatie van de werkzaamheid van antibacteriële verbindingen en vaccins.

Protocol

1. Longinfectie door intratracheale intubatie Weeg muizen en, optioneel, markeringen kan worden gemaakt op de oren voor gemakkelijke identificatie. Verdoven van de muizen met ketamine (100 pg per gram muis gewicht) en xylazine (10 pg per gram van muis gewicht) door intraperitoneale inenting. Plaats muizen in kooien tot volledig verdoofd. Knijp de pads van hun voeten te trappen reflex te controleren. Muizen getoond moet worden verminderd of geen reflex reactie. Plaats de muis op d…

Discussion

Hoewel het volgen van deze protocollen zal meestal resulteren in hoge kwaliteit beelden, is het belangrijk om een ​​paar belangrijke punten te overwegen om accurate en consistente gegevens uit beeldvormend onderzoek te verkrijgen. Luminescentie afbeeldingen moeten worden verworven die telt van 600 tot 60.000 om ervoor te zorgen dat het signaal boven de achtergrond en de camera is niet verzadigd. Indien de verkregen signaal is minder dan 600 de blootstelling voorwaarden moeten worden aangepast aan de tellingen te ver…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken de Cirillo laboratorium leden voor waardevolle discussies en hulp in deze studie. Wij danken dr. Joshua Hill en het laboratorium van Dr James Samuel voor hulp bij het tijdens de opnames van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door subsidie ​​48.523 van de Bill & Melinda Gates Foundation en het verlenen van AI47866 van de National Institutes of Health.

Materials

Material Name タイプ Company Catalogue Number Comment
Isoflurane   VETONE 501027  
Ketamine   Butler animal health supply    
Xylazine   MP Biomedical 158307  
Luciferin   GMT LUCK-100  
Fetal plus solution   VOR tech pharmaceutical    
Cathether (22G x 1”)   TERUMO OX2225CA  
Guide wire   Hallowell EMC 210A3491  
Octocope with speculum   Hallowell EMC 000A3748  
Xenogen IVIS system   Caliper Life Sciences    
XGI-8-gas Anesthsia System   Caliper Life Sciences    
Living Imaging Software   Caliper Life Sciences    
Transparent nose cones   Caliper Life Sciences    
Light baffle divider   Caliper Life Sciences    

参考文献

  1. Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
  2. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
  3. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
  4. Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
  5. Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
  6. Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
  7. Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
  8. Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
  9. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
  10. Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
  11. Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
  12. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).

Play Video

記事を引用
Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice. J. Vis. Exp. (48), e2547, doi:10.3791/2547 (2011).

View Video