Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm
概要
Die Virochip ist ein pan-virale Microarray entwickelt, um gleichzeitig zu erkennen alle bekannten Viren sowie neue Viren auf der Basis von konservierten Sequenzhomologie. Hier zeigen wir, wie man ein Virochip Testlauf zu klinischen Proben auf das Vorhandensein von sowohl bekannte als auch unbekannte Viren zu analysieren.
Abstract
Die Diagnose von viralen Ursachen vieler Infektionskrankheiten ist schwierig aufgrund der inhärenten Reihenfolge Vielfalt der Viren sowie die laufende Aufkommen neuer viraler Erreger wie SARS-Coronavirus und 2009 pandemische H1N1-Influenza-Virus, die nicht nachweisbar sind mit herkömmlichen Methoden. Um diese Herausforderungen anzugehen, haben wir bereits entwickelt und validiert eine pan-virale Microarray-Plattform namens Virochip mit der Fähigkeit, alle bekannten Viren sowie neue Varianten auf Basis der konservierten Sequenz Homologie 1 zu erfassen. Mit dem Virochip, haben wir das gesamte Spektrum der Viren mit Infektionen der Atemwege, einschließlich Fälle von ungeklärter critical illness bei hospitalisierten Patienten mit einer Empfindlichkeit entspricht oder überlegen gegenüber herkömmlichen klinischen Tests 2-5 assoziiert identifiziert. Die Virochip wurde auch genutzt, um neue Viren zu identifizieren, einschließlich des SARS-Coronavirus 6,7, einem neuartigen Rhinovirus Clade 5, XMRV (ein Retrovirus in Verbindung mit Prostata-Krebs) 8, Vogelgrippe Bornavirus (die Ursache eines Wasting Disease bei Papageien) 9, und eine neuartige cardiovirus bei Kindern mit Atemwegs-und Durchfallerkrankungen 10. Die aktuelle Version des Virochip hat zu einer Agilent Microarray-Plattform portiert worden und besteht aus ~ 36.000 Sonden aus über ~ 1.500 Viren in GenBank Stand Dezember 2009 abgeleitet. Hier zeigen wir die Schritte in der Bearbeitung eines Virochip Assay von Anfang bis Ende (~ 24 Stunden Bearbeitungszeit), einschließlich Probe Nukleinsäure-Extraktion, PCR-Amplifikation mit Random-Primern, Fluoreszenzfarbstoff Einarbeitung und Microarray-Hybridisierung, Scannen und Analyse.
Protocol
Discussion
Die Virochip Protokoll, wie hier beschrieben ist komplex und erfordert eine sorgfältige und qualifizierte Forschungs-Techniker. Richtig Reagenz-Konzentrationen und Bedingungen für die PCR, Kennzeichnung und Hybridisierung sind kritisch. Die Virochip Protokoll kann leicht modifiziert werden, um die Analyse der erkrankten Geweben durch die Verwendung eines Gewebes Extraktionsmethode wie TRIzol (Invitrogen) zur Nukleinsäure-Extraktion unterzubringen. Probes können hinzugefügt oder gelöscht werden, wie notwendig, um das gewünschte Spektrum und Breite der Abdeckung zu erzielen, z. B. Sonden zum Nachweis von viralen Ziele wie Bakterien und Pilze können entwickelt und hinzugefügt werden "on-the-fly". Einige Anwendungen des Virochip Assay derzeit in Entwicklung sind Breitspektrum-virale Diagnostik im klinischen Labor, Ausbruch Untersuchung, Reinheit Screening von Medikamenten und Impfstoffen sowie neuartige virale Erreger entdeckt.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, und Alexander Greninger für die initiale Entwicklung und Optimierung der Virochip Protokoll. Diese Arbeit wird durch ein NIH K08 zu gewähren und Abbott Discovery Award (CC) und dem Howard Hughes Medical Institute (bis JLD) unterstützt.
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
参考文献
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler’s murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
