Protocole décrivant l'application d'un système de cellule à circulation pour la croissance et l'analyse des biofilms microbiens pour la microscopie confocale à balayage laser (CLSM).
Beaucoup de cellules microbiennes ont la capacité de former des communautés microbiennes sessiles défini comme les biofilms qui ont modifié les propriétés physiologiques et pathologiques par rapport aux micro-organismes vivant en liberté. Les biofilms dans la nature sont souvent difficiles à étudier et résider sous peu les conditions définies 1. En utilisant un substrat transparent, il est possible d'appareil un système où les biofilms simples peuvent être examinées de manière non destructive en temps réel: ici nous montrer le montage et le fonctionnement d'un système modèle de flux de cellules, pour des études in vitro en 3D des biofilms microbiens générant une grande reproductibilité dans des conditions bien définies 2,3.
Le système se compose d'une cellule d'écoulement qui sert de chambre de croissance pour le biofilm. La cellule de débit est fourni avec les nutriments et l'oxygène à partir d'un flacon de support via une pompe péristaltique et moyennes passé est recueillie dans un conteneur à déchets. Cette construction du système d'écoulement permet un approvisionnement continu de nutriments et de l'administration d'antibiotiques par exemple avec une perturbation minimale des cellules cultivées dans la chambre d'écoulement. Par ailleurs, les conditions d'écoulement dans la cellule de flux permettent d'études du biofilm exposées à un stress de cisaillement. Une bulle de bulles d'air dispositif de confine de la tubulure qui, autrement, pourrait perturber la structure du biofilm dans la cellule d'écoulement.
Le système de pile est compatible avec les flux de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et peut ainsi offrir des informations très détaillées en 3D sur le développement des biofilms microbiens. Les cellules dans le biofilm peut être étiquetée avec des sondes fluorescentes ou des protéines compatibles avec l'analyse CLSM. Cela permet la visualisation en ligne et permet l'étude des niches dans le biofilm en développement. Interrelation microbiens, enquête sur les agents antimicrobiens ou l'expression de gènes spécifiques, sont des configurations de nombreuses expériences qui peuvent être étudiés dans le système de cellule d'écoulement.
Nous avons démontré un système de cellules d'écoulement qui représente un outil puissant dans les enquêtes de biofilm. Combiné avec l'imagerie 3D par microscopie confocale, le système a une gamme d'avantages en comparaison à d'autres méthodes d'analyse des biofilms microbiens par des moyens plus traditionnels des techniques microscopiques. Ce système permet la visualisation 3D de la vie des communautés microbiennes du biofilm sans perturbation de la communauté. La microscopie optique ne sera pas fournir des informations détaillées sur des niches du biofilm et tandis que la microscopie électronique offre une résolution nanométrique du biofilm, il ne permet pas l'imagerie de cellules vivantes.
En utilisant le système d'écoulement décrite canal, nous avons déjà élucidé la distribution spatiale des cellules bactériennes sensibles à plusieurs antibiotiques 5-8 (figure 4a), la distribution des composés extracellulaires, par exemple, l'ADN 9-11 et la distribution des cellules mobiles et non mobiles des la même espèce au sein d'une communauté bactérienne 4,6,9 (figure 4C). Nous prévoyons que le système de la cellule à flux peuvent être utilisées pour étudier les aspects de biofilms levure. Cela peut être la distribution spatio temporelle du biofilm levure en réponse à des facteurs environnementaux tels que les fongicides ainsi que l'identification de gènes impliqués dans le développement du biofilm levure. Bien que la levure n'est pas connue pour se différencier en cellules mobiles et non mobiles, d'autres aspects de la diversification de biofilm peut être des études telles que le changement morphologique des cellules de la levure à pseudohyphal et le passage de cellules diploïdes d'haploïdes.
Nous avons montré un système qui se conformer à plusieurs espèces microbiennes et travaillera avec plusieurs techniques de coloration. Une variété de sondes coloration différente et des protéines fluorescentes, comme la GFP, à permettre des enquêtes créneau spécifique dans le biofilm en développement et est un outil efficace dans l'analyse de l'effet des agents antimicrobiens ou d'autres facteurs environnementaux. Les informations qui peuvent être acquises est très détaillé (figure 4) et des fonctionnalités dans le biofilm peut être quantifié avec des programmes informatiques tels que COMSTAT 12,13.
Globalement, l'aspect le plus critique de ce protocole est le fait qu'il est un processus fastidieux. Il est aussi une limitation que les cellules doivent être capables de croître sur un non-fluorescents, surface transparente. . Depuis le biofilm formé est analysé à l'aide d'un microscope confocal, la profondeur qui peut être étudié est limité à quelques centaines de micromètres 14 Il ya encore des limitations techniques inhérentes à la conception: le système n'est pas adapté pour le criblage haut débit, comme un chercheur expérimenté peut traiter au maximum d'environ 15 canaux par expérience, ce qui peut prendre plusieurs jours pour se préparer. Toutefois, les antibiotiques ou des mutants qui sont jugées pertinentes pour des études biofilm peut être initialement projeté de masse avec d'autres méthodes telles que la coloration au cristal violet, avant les candidats les plus intéressants sont transférées vers le système cellule d'écoulement. Les feuilles de verre de couverture sont très minces et cassants, et les soins devraient être prises lors de la manipulation des systèmes. En outre, le tube doit être examinée par jour pendant l'exécution d'une expérience; aussi considérable "retour à la croissance» dans les tubes d'entrée juste en amont du flux de cellules peuvent se produire. Une telle contamination peut être résolu en supprimant plusieurs centimètres de tube en silicone du côté entrée des cellules d'écoulement, en utilisant une technique stérile.
Figure 4 a) 4 jours PAO1 anciens -. Biofilm GFP traitées pendant 24h avec la colistine et l'iodure de propidium pour la coloration de morts (tache rouge) b) présentation en 3D d'une journée de trois anciens P. aeruginosa PAO1 (type P. aeruginosa sauvage) – GFP biofilm 6 c) la présentation d'une image 3D PAO1 – PCP pilA mutant (bleu) avec une PAO1 type sauvage YFP (jaune) d) cinq jours anciens PAO1 – GFP biofilm présenté comme un 3D e photo) 26 h S. cerevisiae (ptr3 mutantes dans CEN.PK fond) biofilms colorés avec Syto-9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |