SELEX协议包括多轮选拔,其中每一个需要结合的配体,这反过来又需要固定的引物序列,侧翼的随机库地区的再生。这些固定的引物序列,可以干扰与选择过程(误报和底片)。在这里,我们目前无底漆的协议。
适配是高度结构化的寡核苷酸(DNA或RNA),可以结合与亲和力与抗体 1的目标。他们发现通过体外筛选过程称为指数富集的配体(SELEX) 的系统演化,识别目标的种类繁多,从小分子蛋白质和2-4等大分子物质。适配,以及适合在体内诊断和/或治疗应用的属性:除了良好的特异性和亲和力,他们很容易合成,更严格的加工条件下生存,他们是不良的免疫原性,其规模相对较小,可能会导致在轻便渗透组织。
通过标准SELEX过程中确定的适配通常包括〜80个核苷酸(NT),因为它们通常是从〜40 nt的随机地区,再加上每边固定引物位点的〜20 NT的核酸库中选择。固定引物序列,从而可以由近〜50%的库序列,因此可能会产生积极或消极的妥协,在遴选过程中 3适配识别,生物信息学方法虽然建议的固定序列,不作出重大贡献后, 选择 5到适体的结构。为了解决这些潜在的问题,引物序列互补的寡核苷酸被封锁或交换在SELEX 6轮中途不同的序列,或已修整至新台币7,8 6-9。温家宝和灰色9设计了引物基因组SELEX方法,其中引物序列完全不同于前选择库中删除,然后再生,让选定的基因组片段的扩增。然而,聘请技术,一个独特的基因组库将建造,拥有有限的多样性,和轮筛选后的再生依赖线性reamplification步骤。另外,努力规避固定序列的引物,使用高效率的分区造成的问题,会见了 PCR扩增10的问题。
我们已经开发出一个引物(PF)的选择方法,大大简化了SELEX程序,并有效地消除了引物干扰问题,11,12 。协议工作在一个简单的方式。中央库中随机地区是没有多余的侧翼序列和纯化绑定到一个合适的目标(例如纯化的蛋白质或复杂的混合物,如细胞株)。绑定序列得到侧翼序列团聚,并重新放大,生成选定的子库。作为一个例子,在这里我们选择适配S100B蛋白,黑色素瘤的蛋白标记。结合实验显示,在10 -7 Kd的小号- 10 -8 M系列选择了几个回合后 ,我们表明,适配功能有效三明治约束力格式。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢克雷格保罗在他的帮助芯片的核心设施。这项工作得到了NIH / NCI的津贴#CA118591的iMAT计划。民主左翼联盟也承认一个宾夕法尼亚州的财政支持空间格兰特财团奖学金。本刊物是由美国宾夕法尼亚州立大学材料研究所纳米加工网络和美国国家科学基金会合作协议0335765号,国家纳米技术基础设施网络,与美国康乃尔大学的支持。
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
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Tris-HCl | ||||
HotMaster TAQ DNA Polymerase | 5-Prime | |||
dNTP Mix | Sigma | |||
Acrylamide | Fisher | |||
UltraPure 10X TBE Buffer | Invitrogen | |||
Ammonium Persulfate | Bio-Rad | |||
TEMED | Fisher | |||
PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker | Promega | |||
Ethidium Bromide | ||||
α-32P-dCTP | ||||
Phenol:ChCl3:IAA | Ambion | |||
NaCl | ||||
Ethanol | ||||
Restriction Enzymes | NEB | |||
Urea | Fisher | |||
Photographic Film | ECE Scientific | |||
PBS | Gibco | |||
CaCl2 | Gibco | |||
MgCl2 | Gibco | |||
Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | |||
Polypropylene Column | Qiagen | |||
NaHPO4 | ||||
NaAc | ||||
Detroit-551 cells | ||||
SK-MEL-31 cells | ||||
MEM | ||||
TrypLE Express | Gibco | |||
T4 DNA Ligase | NEB | |||
Dimethyl Sulfoxide | Promega | |||
Sp6 RNA Polymerase | Promega | |||
RNase-Free DNase I | Promega | |||
RNase Inhibitor | Promega | |||
SensiScript Reverse Transcriptase | Qiagen | |||
pCR-2.1-TOPO Vector | Invitrogen | |||
DH5α Compotent Cells | Invitrogen | |||
Plasmid Mini Kit | Qiagen | |||
Vector NTI | Invitrogen | |||
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | |||
γ-32P-ATP |