سيليكس بروتوكولات تشمل جولات متعددة من الاختيار ، كل منها تتطلب تجديد يغاندس ملزمة ، وهذا بدوره يتطلب تسلسل التمهيدي ثابتة في المناطق المحيطة مكتبة عشوائي. يمكن لهذه التسلسلات التمهيدي الثابتة تتداخل مع عملية التحديد (كاذبة ايجابيات وسلبيات). هنا نقدم التمهيدي خالية من البروتوكول.
[أليغنوكليوتيد] الأبتامرات ومنظم للغاية (DNA أو RNA) التي يمكن ربط الصلات مع أهداف مماثلة لأجسام مضادة 1. يتم تحديدها من خلال عملية انتقاء في المختبر يسمى التطور المنهجي للتخصيب بواسطة يغاندس الأسي (سيليكس) إلى التعرف على تشكيلة واسعة من الأهداف ، من جزيئات صغيرة على البروتينات والجزيئات الأخرى 2-4. الأبتامرات والخصائص التي هي مناسبة تماما للتشخيص في الجسم الحي و / أو التطبيقات العلاجية : وبالاضافة الى نوعية جيدة وتقارب ، تم تجميعها بسهولة ، البقاء في ظروف تجهيز أكثر صرامة ، فهي مناعة ضعيفة ، وصغر حجمها نسبيا يمكن أن تؤدي إلى اختراق من السهل الأنسجة.
الأبتامرات التي يتم تحديدها من خلال عملية سيليكس القياسية تشمل عادة ~ 80 النيوكليوتيدات (NT) ، حيث عادة ما يتم اختيار هؤلاء من مكتبات الحمض النووي مع ~ 40 مناطق العشوائية NT طويلة بالاضافة الى المواقع الثابتة للNT التمهيدي 20 ~ على كل جانب. تسلسل التمهيدي ثابتة وبالتالي يمكن أن تشمل ما يقرب من 50 ٪ من ~ تسلسل المكتبة ، وبالتالي قد سلبا أو إيجابا سطا تحديد الأبتامرات في عملية الاختيار 3 ، على الرغم من أن النهج المعلوماتية الحيوية تشير إلى أن تسلسل ثابت لا تساهم بشكل كبير في هيكل aptamer بعد اختيار 5 . لمعالجة هذه المشاكل المحتملة ، وقد تم حظر متواليات التمهيدي من قبل [أليغنوكليوتيد] تكميلية أو تحول إلى سلاسل مختلفة في منتصف الطريق خلال جولات سيليكس 6 ، أو تم قطع عليهم 6-9 NT 7 و 8. ون جيا باو ورمادي 9 تصميم التمهيدي خالية من الأسلوب سيليكس الجينومية ، والتي أزيلت تماما تسلسل التمهيدي من المكتبة قبل الاختيار وكانت مجدد ثم السماح التضخيم من شظايا الجينومية المحدد. ومع ذلك ، لاستخدام هذه التقنية ، ومكتبة فريدة من نوعها الجينومية أن يتم بناؤها ، والتي تمتلك التنوع محدودة ، وتجديدها بعد جولات من الاختيار يعتمد على خطوة reamplification الخطية. بدلا من ذلك ، واجتمعت الجهود لتجاوز مشكلات الناجمة عن تسلسل التمهيدي الثابتة باستخدام تقسيم عالية الكفاءة مع المشاكل المتعلقة PCR التضخيم 10.
قمنا بتطوير التمهيدي خالية طريقة الاختيار (الجبهة الوطنية) التي تبسط الإجراءات بشكل كبير سيليكس ويزيل بفعالية التمهيدي التدخل مشاكل 11 و 12. بروتوكولات العمل بطريقة مباشرة. يتم تنقية المنطقة الوسطى عشوائية من المكتبة دون تسلسل دخيلة واقية ومنضما الى هدف مناسب (على سبيل المثال إلى البروتين النقي أو مخاليط معقدة مثل خطوط الخلية). ثم يتم الحصول على تسلسل محدد ، لم شملهم مع تسلسل المرافقة ، وإعادة تضخيم لتوليد فرعية مختارة المكتبات. كمثال على ذلك ، اختارت نحن هنا لالأبتامرات S100B ، علامة البروتين لسرطان الجلد. وأظهرت فحوصات ملزمة دينار في ق (10) و-7 — 10 -8 M مجموعة بعد بضع جولات من الاختيار ، وعلينا أن نظهر أن الأبتامرات العمل بفعالية في شكل شطيرة ملزمة.
The authors have nothing to disclose.
نشكر بول كريج في مرفق ميكروأري الأساسية لمساعدته. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة CA118591 # / NCI منحة من برنامج IMAT. SLD يقر أيضا مساحة ولاية بنسلفانيا زمالة اتحاد المنح للحصول على الدعم المالي. كما أيد هذا المنشور من قبل الدولة جامعة بنسلفانيا مواد معهد بحوث نانو شبكة التصنيع الوطنية للعلوم والاتفاق التعاوني المؤسسة رقم 0335765 ، البنية التحتية للشبكة الوطنية لتقنية النانو ، مع جامعة كورنيل.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris-HCl | ||||
HotMaster TAQ DNA Polymerase | 5-Prime | |||
dNTP Mix | Sigma | |||
Acrylamide | Fisher | |||
UltraPure 10X TBE Buffer | Invitrogen | |||
Ammonium Persulfate | Bio-Rad | |||
TEMED | Fisher | |||
PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker | Promega | |||
Ethidium Bromide | ||||
α-32P-dCTP | ||||
Phenol:ChCl3:IAA | Ambion | |||
NaCl | ||||
Ethanol | ||||
Restriction Enzymes | NEB | |||
Urea | Fisher | |||
Photographic Film | ECE Scientific | |||
PBS | Gibco | |||
CaCl2 | Gibco | |||
MgCl2 | Gibco | |||
Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | |||
Polypropylene Column | Qiagen | |||
NaHPO4 | ||||
NaAc | ||||
Detroit-551 cells | ||||
SK-MEL-31 cells | ||||
MEM | ||||
TrypLE Express | Gibco | |||
T4 DNA Ligase | NEB | |||
Dimethyl Sulfoxide | Promega | |||
Sp6 RNA Polymerase | Promega | |||
RNase-Free DNase I | Promega | |||
RNase Inhibitor | Promega | |||
SensiScript Reverse Transcriptase | Qiagen | |||
pCR-2.1-TOPO Vector | Invitrogen | |||
DH5α Compotent Cells | Invitrogen | |||
Plasmid Mini Kit | Qiagen | |||
Vector NTI | Invitrogen | |||
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | |||
γ-32P-ATP |