Сотовые Электромуфтовая Визуализированные с флуоресцентной микроскопии

I. Загрузка клеток с сотового трекеры CMFDA и CMRA Эксперименты проводились на заранее подготовленные клетки меланомы мыши клеточной линии (B16-F1). Клетки, выращенные в двух отдельных 25 см 2 колбах культуры (ТЭС, ZDA) до 70-80% слияния в культуральной среде DMEM (среда Дульбекко изменение Орла) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,15 мг / мл L-глутамина, 16 мг / мл гентамицина (все от Sigma-Aldrich, Германия), 200 ед / мл crystacillin (Плива, Хорватия), и инкубировали в 5% CO 2 при температуре 37 ° C. Приготовьте два 10 мМ растворы клеточных трекеры (Invitrogen, США), добавляя 10,76 мкл и 9 мкл (для зеленого CMFDA и оранжевой CMRA, соответственно) ДМСО (Sigma-Aldrich, Германия) до 50 мкг красителя в исходном Invitrogen флаконе. Маточный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Перед началом экспериментов, разогреть решение пока кристаллы ДМСО растворяются. Подготовка бикарбоната без Кребса Hepes буфера (130 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO 4, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 11,7 мМ D-глюкозы, 1,3 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES, рН 7,4). В двух 15 мл Eppendorf труб отдельно смеси 2,1 мкл каждого стандартного раствора (10 мМ CMFDA или CMRA, соответственно) в 3 мл бикарбоната без Кребса Hepes буфера. Это дает "загрузки решение", содержащий около 7 мкМ CMFDA (или CMRA). Промойте клетки в два раза с бикарбонатом без Кребса Hepes буфер, а затем вставить загрузку решений в колбах. Инкубируйте клетки в течение 30 минут в 5% CO 2 при температуре 37 ° C. Во время этой первой инкубации реагентов свободно проходить через клеточные мембраны, но как только внутри клетки, реагенты превращаются в клеточной impermeant флуоресцентных продуктов реакции. После первой инкубации, промыть и инкубировать клетки с питательной среде в течение еще ​​двух часов в 5% CO 2 при температуре 37 ° C. Trypsinize клетки в обоих колбах (загружается с CMFDA и CMRA) и смешать красный и зеленый клетки вместе в соотношении 1:1 в 50 мл центрифужную пробирку (ТЭС, ZDA). Отрегулируйте концентрацию клеток до 5 х 10 6 клеток / мл путем разбавления среды DMEM или концентрации с центрифугой. Место 20 мкл каплю суспензии клеток в каждой лунке от 24 многоямного пластины (ТЭС, ZDA). Инкубируйте клеток в 5% CO 2 при 37 ° С в течение 20 минут, чтобы позволить им немного приложить к поверхности хорошо и установить контакты клетка. II. Электромуфтовая Подготовка isoosomolar фосфатного буфера калия (10 мМ КН2РО4, 10 мМ K 2 HPO 4, 1 мМ MgCl 2, 250 мМ сахарозы) и hypoosmolar калий фосфатного буфера (10 мМ КН2РО4, 10 мМ K 2 HPO 4, 1 мМ MgCl 2, 75 мМ сахарозы) . Место многоямного с ячейками на столике микроскопа, положение электродов на дно колодца и соединить их с генератора импульсов. Вымойте клеток с 1 мл isoosomolar калий фосфатного буфера. Добавить 350 мкл hypoosmolar калий фосфатного буфера, чтобы вызвать отек ячейки. Буфер должен покрывать электроды. Оставьте клеток в hypoosmolar буфера в течение 2 минут перед нанесением электрических импульсов. За это время приток молекул воды в клетки из-за осмотического дисбаланса между внутренней и внешней стороне клетки причиной увеличения объема клеток. Электрические импульсы должны применяться, когда клетки близки к максимальным объемам, прежде чем начать нормативно уменьшения громкости. Для достижения оптимального электромуфтовой и поддерживать жизнеспособность клеток, оптимальных параметров электрических импульсов должен быть использован. Они зависят от клеточной линии использовались [1]. В этом эксперименте поезд из 8 прямоугольных импульсов (каждый продолжительностью 100 мкс с частотой 1 Гц) применяется к каждому образцу, используя электропорации устройства (в нашем случае Cliniporator, IGEA, Италия). Импульсы поступают в двух параллельных Pt / Ir электродов проволоки с диаметром 0,8 мм и 5 мм расстояние между ними, создавая электрическое поле около 1200 В / см между электродами в каждой лунке, за исключением контрольный колодец. Оставьте клетки в покое на 10 минут после импульса доставки. Определить слияние выход с помощью флуоресцентной и фазового контраста микроскопии. III. Приобретение изображения и определение слияния выход Клетки, наблюдаемые с помощью флуоресцентного микроскопа (в нашем случае Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Германия), оснащенных цели (x20) и охлаждением ПЗС-камеры (VisiCam 1280, Visitron, Германия). Изображения, приобретенные в Метаморф 7.1.1 (Molecular Devices, США), но и других подобных программ приобретения также могут быть использованы. CMFDA волнует монохроматора (полихромные IV, Visitron, Германия) при 492 нм и CMRA на 548 нм. Флуоресценции CMFDA и CMRA приобретается с помощью двух выбросов фильтрами, один с центром в нм 535 (HQ535/30m, для CMFDA), а другая с центром в точке 510 нм (D605/55m, для СMRA, как Chroma, США). Использование дихроичных зеркала (Q515LP) помешали говорить канал крест. Приобретать три изображения (фазового контраста, красного и зеленого свечения) в течение пяти случайно выбранных полей в каждую лунку. Создать три изображения канала от каждого изображения триплет. В таких изображений флуоресцирующих цитоплазму можно увидеть вместе с клеточных мембран. Плавленый клетки Таким образом, можно легко определить [Рисунок 1]. Подсчет всех трех типов клеток (красный, зеленый и двойственно флуоресцентные) в каждом три канала изображения. Определить процент дуально флуоресцентные клетки путем деления числа дуально флуоресцентных клеток с числом всех клеток в каждом изображении. Fusion доходность определяется как процент дуально флуоресцентные клетки умножаются на 2, так как половина плавленого клеток не обнаружено (когда клетки одного и того же предохранитель цвета). Представитель Результаты Рисунок 1 Три канала микроскопии образ B16F1 клеток после электромуфтовой. Фазового контраста, CMRA флуоресценции (возбуждение при 548 нм) и CMFDA флуоресценции (возбуждение при 492 нм), цель увеличение 20x