نحن نطبق التسمية خالية من تحليل التفاعل البروتين باستخدام X100 Biacore للهيكل وظيفة تحليل الربط العديد من المسوخ B cystatin إلى غراء من خلال توصيف الحركية. المعايرة خالية من التحليل تركيز (CFCA) يقيس تركيز البروتين مع النشاط ملزم الاحتفاظ دون الحاجة إلى منحنى القياسية. نظهر أن تأكيد باستخدام تركيزات CFCA يزيد من مصداقية هذا التحليل الحركي ويمكن أن يعتمد عليه أن يحدد الثوابت الحركية حتى إذا تم خفض نشاط بروتين المؤتلف.
في هذه الدراسة ، ونحن استكشاف التفاعل بين الابقار البروتيني السيستين باء cystatin المانع وشكل غير نشط من غراء حفاز (الشكل 1) ، وهو الأنزيم البروتيني السيستين النباتية ، في الوقت الحقيقي من خلال تحليل التسمية خالية باستخدام X100 Biacore. ويتم إنتاج العديد من المتغيرات B cystatin مع الطفرات نقطة في مجالات التفاعل مع غراء. لكل cystatin الخيار باء نحدد تركيزه ملزمة محددة باستخدام المعايرة خالية من التحليل تركيز (CFCA) وقارن بين القيم التي تم الحصول عليها مع تركيز البروتين الكلي وفقا لما يقرره<sub> 280</sub>. بعد ذلك ، يتم قياس حركية كل cystatin الخيار باء ملزم لاحد باستخدام غراء دورة حركية (SCK). نظهر أن واحدا من المتغيرات cystatin B الأربع الذي هو دراسة النشطة فقط جزئيا عن الربط. هذا النشاط الجزئي ، التي كشفت عنها CFCA ، يترجم إلى اختلاف كبير في معدل تكوين الجمعيات ثابت (<em> ك</em<sub> A</sub>) وتقارب (<em> K</em<sub> D</sub>) ، بالمقارنة مع مجموع القيم المحسوبة باستخدام تركيز البروتين. CFCA به بالاشتراك مع التحليل الحركي في دراسة بنية وظيفة تساهم في الحصول على نتائج موثوق بها ، ويساعد على جعل التفسير الصحيح لآلية التفاعل.
في هذا العمل ، وأنتج أربعة المسوخ البرية وباء cystatin نوع من أجل تقييم أهمية حلقة الربط الثاني وتنتهي C – محطة للتفاعل بين B cystatin وغراء. أظهرت هذه الدراسة الميزة وسهولة استخدام X100 Biacore لتحديد تركيز محددة ملزمة ، وتحليل حركية من البروتين البروتين التفاعلات من أجل فهم بنية وظيفة العلاقات. أثبتنا أن مجموع قياس تركيز البروتين لا تكشف المتغيرات البروتين التي خفضت النشاط ملزم ، وهو في هذه الحالة يقدم الخطأ قياس كبير في تحديد تقارب ملزمة وحركية. وتحددت تركيزات محددة وملزمة من المتغيرات B cystatin باستخدام CFCA مع X100 Biacore. أدى تركيز باستخدام القياسات التي CFCA كمدخل لتحليل الحركية في معدل موثوق بها والثوابت تقارب ، مما يسمح للالتفسير الصحيح لآلية التفاعل.
كانت الانتماءات انخفض من المسوخ على وجه الحصر تقريبا بسبب القيمة د ك زيادة ، في حين كان ك تتأثر إلا قليلا. هذا السلوك يشير إلى أن كلا من المنطقة الثانية حلقة الربط ونهاية C – المحطة ليست مهمة بالنسبة لمعدل ربط المانع للغراء. بدلا من ذلك ، أنها تسهم في تقارب ملزمة في المقام الأول عن طريق الحفاظ على مثبطات الانزيم تعلق على مرة واحدة وقد تم تشكيل المجمع.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Biacore™ X100 System | GE Healthcare | BR-1100-73 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html | |
Biacore™ X100 Plus Package | GE Healthcare | BR-1007-98 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html | |
Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1000-14 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html | |
Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | ||
Acetate buffer pH 4.5, 50 ml | GE Healthcare | BR-1003-50 | ||
HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml | GE Healthcare | BR-1008-26 | ||
Plastic Vials Ø 11 mm | GE Healthcare | BR-1002-87 | ||
Rubber caps, type 2 | GE Healthcare | BR-1004-11 |