上颌Barbel斑马鱼的研究方法

斑马鱼的饲养斑马鱼是按1标准方法安置和饲养。过去的后期幼虫时期，一个斑马鱼的发育阶段可以衡量它的标准长度（SL），或从上唇anteriormost的角度以毫米为单位的直线距离尾鳍（posteriormost hypural板）的基础2。在受精后约一个月（SL 10-12毫米），鼻和上颌骨的触须出现嗅觉坑附近的颚后的角落，分别为透明上皮芽。由于斑马鱼的成熟，触须延伸到狭窄，晶须状的附加物。由于上颌barbel较大（2-3毫米），更易于操作，我们的协议只适用于这个特定的附属物;然而，类似的技术，可适应较小的鼻barbel。 Barbel裁剪在所需的阶段（例如，1.5-2.5厘米SL，〜3-6个月后受精）麻醉成年斑马鱼浸泡在0.015％的MS – 222（乙基氨基磺酸）缓冲系统水的pH值7.0。和鳃通风变得缓慢和定期观察，直到停止游泳运动。根据鱼的大小，完成麻醉大约需要2-5分钟。 使用水族馆渔网，一次传输一个在培养皿中的湿纸巾折叠1-3鱼。使用钝的铲，东方的鱼，所以他们是平行的相互左外侧的一面向上。在覆盖了整个身体的鳃盖鱼（鳃盖）在手术过程中保持湿润的皮肤和鳃尾部分湿纸巾的褶皱部分。 体视显微镜下的Petri板，采用低角度的入射光照射头部区域。专注于左上颌窦barbel，突出从上颌骨后腹角（图1）的基础。 图1。 紧紧抓住的barbel颌骨边缘略有远端轴。提升barbel轴，并插入一个细尖的春天剪刀钳的近端的下颌。可触及的剪刀，镊子稳定。滑动轴的barbel剪刀的颌骨，直到尖端接近颌骨边缘。关闭剪刀划破barbel轴。截肢barbel，仍然笼罩在镊子，可用于固定或进一步的观察中删除。 马上转移到一个干净的系统的水（约500毫升）含一滴亚甲蓝控制浅部真菌感染的小坦克鱼。让鱼一夜之间恢复。第二天早上，返回鱼的饲养系统。 Barbel再生是最大的，2周后。 琼脂嵌入匹配Barbel对通过适当的安乐死技术收集的鱼类和修复的4％，50毫升管多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）在4 ° C过夜搅拌。固定液的量应至少组织量的十倍。固定后，在核准的容器中的多聚甲醛废物处置和组织彻底冲洗PBS的几个变化。 准备一个250毫升的玻璃烧瓶150毫升的2％琼脂糖（ 的 Tm〜37 ° C）蒸馏水。微波炉或热板加热，搅拌至完全溶解定期。在50-60℃水浴平衡的熔融解决方案。 一个标准的凝胶电泳钻机组装放置一个小垫片胶的模具（10 × 10厘米〜100毫升凝胶体积）坚决反对的缓冲室的两侧。 2-4小齿样本的梳子（4 × 1.5毫米）。 在一个水平面上，倒入模具融化的琼脂糖刚好盖住的梳子基地，形成很浅水井。立即把剩余的琼脂糖回温水浴，这将在以后使用嵌入组织（步骤9-12）。一个长长的玻璃巴斯德吸管放入烧瓶中，保持相同的温度琼脂糖的吸管。 允许凝胶硬化20-30分钟。取出的梳子，然后删除包含从缓冲室，硬化凝胶的凝胶模具。坚决凝胶模具实验室磁带的磁带的开放两岸，使凝胶不会滑出。这盘录像带，应延长在琼脂糖表面几毫米，所以可以在以后添加额外的琼脂糖（13步）。 立体显微镜下阶段的凝胶模具的位置。放大一个空井，并把关注焦点的边缘。 上井相邻的琼脂糖表面，吸一滴的水或缓冲液固定barbel标本（ 例如，重新生成和控制）。 USI吴弯曲昆虫引脚，潮湿的标本，并将其推入井拖动底部。东方barbel轴相互平行，对井对面的长边对齐。表面张力，将有助于保持的组织中的地位。 当准备嵌入，使用罚款枪头或删除多余的液体从井实验室组织的角落。工作很快，所以不要让组织干出来的。 使用加热玻璃巴斯德吸管，轻轻吸液管和周围的标本新鲜熔化琼脂糖密封barbel组织。不要装得太满。琼脂糖变硬之前，与昆虫引脚的最后一分钟的调整。 井旁边放置一个编号的纸张样本标签和安全用琼脂糖小降。 每个标本以及重复步骤6至10。 如果所需的图像校准，插入一张纸，印刷微米尺度（ 例如 ， http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/）到一个空井的 ​​底部。井底拼合的文件和温暖琼脂糖覆盖。 所有的标本都嵌入后，将凝胶表面不规则，硬化滴琼脂糖。凝胶放置在一个平面上，轻轻地在融化的琼脂糖额外倒，直到上表面均匀。使用量最小的琼脂糖必要获得一个光滑的表面;太多琼脂糖晦涩的透射光摄影。允许此顶层变硬。 凝胶可以被拍下立体显微镜记录每个barbel对大体形态的阶段。图像校准是通过拍摄嵌入式微米尺度。 可以存储整个凝胶包裹在湿纸巾，并在几个星期在4 °塑料袋密封。 作进一步的分析，可以对触须包含匹配的琼脂块切出的凝胶，用手术刀或刀片和石蜡组织学处理，或由3,4标准方法cryosectioning。另外，个体触须可以被解剖的琼脂糖细的针头，在水冲洗，和其他下游应用（ 例如，整个安装的免疫组织化学或激光共聚焦显微镜）处理。