كانوا يعملون Lectin – مترافق الخرز بوروس عن HPLC. خدم معايير ببتيد سكري والضوابط الإيجابية والسلبية. MARS – 14 المستنفد ، كان chromatographed تربسين هضم البلازما البشرية والتدفق من خلال (FT) ، والكسور التي جمعت ملزمة لتحاليل ESI-LC-MS/MS. وقد أثرى Glycopeptides في جزء ملزمة مقارنة FT.
Glycans هي فئة هامة في مرحلة ما بعد متعدية التعديلات. العثور على عادة تفرز خارج الخلية والجزيئات ، وهياكل غليكان إشارة إلى الحالة الداخلية للخلية. Glycans على الخلايا السرطانية تميل إلى أن تكون وفيرة والحامض اللعابي فوكوز الأنصاف. نقترح أن يتم استغلال هذه المتغيرات المرتبطة بالسرطان غليكان العلامات البيولوجية للتنمية تهدف إلى تشخيص المرض في مرحلة مبكرة. تبعا لذلك ، قمنا بتطوير الطيف الكتلي على أساس سير العمل الذي يتضمن اللوني على المصفوفات تقارب تشكلت من lectins ، والبروتينات التي تربط غليكان هياكل محددة. اقترنت تساهمي في lectins خمان ؛ بلسان أسود (SNA) وبرتقالية Aleuria (العال) ، والتي تربط الحامض اللعابي وفوكوز ، على التوالي ، إلى حبات بوروس (النظم البيولوجية التطبيقية) ، ومعبأة في أعمدة PEEK لارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC). باختصار ، كان المنضب البلازما من البروتينات fourteen الأكثر وفرة باستخدام نظام إزالة تقارب متعددة (MARS – 14 ؛ اجيلنت). وفي الوقت نفسه تقلصت البلازما التربسين – هضمها والمنفصلين في التدفق من خلال والكسور ملزمة SNA أو HPLC AAL. تم علاج الكسور مع PNGaseF لإزالة N – مرتبطة glycans ، وتحليلها بواسطة LC-MS/MS على النخبة QStar. وقد تم تحليل البيانات باستخدام برنامج التميمة. تضمنت الضوابط الإيجابية التصميم التجريبي ، وfucosylated sialylated glycopeptides الإنسان واكتوفيرين السلبية تسيطر عالية من glycopeptides مانوز السكيراء البيرة ، التي كانت تستخدم لمراقبة النوعية من التقاط lectin. الميزات الرئيسية لهذا العمل تشمل استنساخ مستمدة من تنسيق HPLC ، وتحديد الإيجابية للأسر وglycopeptides PNGaseF المعاملة من الزخارف الخاصة Asn-Xxx-Ser/Thr deamidated ، وتقييم الجودة باستخدام معايير بروتين سكري. كما تضمن البروتوكول التحسين تحديد نسبة المواد المناسبة للبدء في قدرة العمود ، وتحديد التقاط الأكثر كفاءة ومخازن شطف ، ورصد PNGaseF المعاملة لضمان deglycosylation الكامل. التوجهات المستقبلية تشمل استخدام سير العمل لتنفيذ هذه التجارب اكتشاف مطياف الكتلة المستندة على البلازما من مرضى سرطان الثدي والأفراد السيطرة.
هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة لتحديد وعزل glycopeptides بطريقة غليكان محددة. كما يختلف ارتباط بالغليكوزيل نطاق واسع داخل كائن حي ، لا سيما خلال تطوير والمرضية ، قد تكون قابلة للتطبيق هذه التقنية لمعالجة طائفة واسعة من الأسئلة. على وجه الخصوص ، نحن نستخدم أسلوب انتقائي لتخصيب glycopeptides التي تم تعديلها مع السرطان المرتبطة الحواتم كخطوة أولى نحو اكتشاف العلامات البيولوجية.
وأيد هذا العمل من قبل وتقنيات البروتين السريرية لمبادرة السرطان ، 5U24CA126477 – 04.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Human plasma | We make this in house | |||
Human lactoferrin | Sigma | L0520 | Trypsin-digest before use | |
Yeast invertase | Sigma | I0408 | Trypsin-digest before use | |
Oass HLB SPE cartridges | Waters | WAT094225 | 1 cc volume | |
ZipTip pipet tips | Fisher | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 for 10 ml pipette | |
Tris | Fisher | BP154-1 | 99% | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141 | 99% | |
Calcium chloride | Sigma | C4901 | 96% | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | 98% | |
Acetic acid | Sigma | 242853 | 99.7% | |
pH indicator paper | Fisher | M95903 | Range 0-14 | |
Acetonitrile | Fisher | A998 | 99.9% | |
Formic acid | Pierce | 28905 | 99% | |
Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 14190-136 | Without calcium and magnesium | |
Sodium azide | Sigma | 71289 | 99.5% | |
PNGase F | New England Biolabs | P0705L | Glycerol-free | |
Vacuum-filter flasks | Fisher | SCGVU05RE | 0.2 mm pores | |
POROS-AL beads | Applied Biosystems | 1-6028-02 | ||
Aleuria aurantia lectin | Vector Laboratories | L-1390 | ||
Sambucus nigra agglutinin | Vector Laboratories | L-1300 | ||
Sodium cyanoborohydride | Sigma | 296945 | 5.0 M solution |