Generation af primære mammosfærer: En teknik til at bestemme cellestyrken

En enkelt brystkræft stamcelle giver anledning til en klynge af celler kaldet en primær mammosfære. For at opnå dem, første kultur en brystkræft celle linje indtil 70% til 80% sammenløb, for at sikre cellerne er i deres vækstfase. Tilføj Tripsin-EDTA for at løsne celler fra kolben, og tilsæt et medium med serum for at stoppe virkningen af Tripsin.

Tag nu cellerne i et rør og centrifuge for at få cellepillen. Resuspend pellet i mammosphere medium uden serum og passere suspensionen gennem en celle si cap filter, for at få en enkelt celle suspension. Denne suspension består af stamceller, stamceller og differentierede celler, der viser forskellige proteinudtryk.

CD44 og CD24 er celleoverfladeproteiner, der er karakteristiske for brystkræftstamceller. De er positive for CD44-udtryk og negative for CD24. Isoler celler fra celleophænget ved hjælp af fluorescens eller magnetisk aktiveret cellesortering. Dernæst tage en aliquot og ad trypan blå plet til cellerne, og beregne antallet af levedygtige celler pr milliliter ved hjælp af en hæmocytometer dias for at finde såning tæthed.

Endelig frø cellerne i en seks godt ultra lav klæbende plade, således at cellerne forbliver suspenderet. Inkubat pladen i 5 til 10 dage uden at forstyrre pladen, indtil kuglerne er 40 mikron i diameter. I den følgende protokol, vil vi generere primære mammospheres fra en brystkræft celle linje.

- Arbejde under en steril dyrkning hætte, begynde denne procedure med MCF7 eller MDA-MB-231 celler, der er 70% til 80% sammenløb. Indsug mediet fra kolben. Vask cellerne to gange med PBS, tilsæt derefter Tripsin-EDTA og inkuber i to til seks minutter. Efter løsrivelse, sluk ved at tilføje mammosphere medium, der indeholder 10% FBS.

Når cellerne er løsnet, overføre dem til en 15 milliliter konisk centrifuge rør og spin det 200 gange g ved stuetemperatur i fem minutter. Efter denne centrifugering dekantere supernatanten, derefter genbruges cellerne i en til fem milliliter mammosphere medium. Pipette op og ned 10 gange for at bryde op cellen pellet.

Derefter overføres celleaffjedringen til et 40 mikron cellebelastningshættefilter, og strømmen opsamles i det vedhæftede rør for at opnå en enkelt celleaffjedring. Pipette en 20 microliter aliquot af de resuspended celler på en hæmocytometer og bruge et mikroskop til at undersøge det. Hvis celleklynger observeres som set her, skal du bruge en sprøjte til at videregive suspensionen ind og ud af en 25 gauge nål en eller to gange.

Når cellerne er blevet spredt i en enkelt celle suspension som vist her, fortsætte med at isolere CD44 positive, CD24 negative cellulære delsæt via fluorescens aktiveret cellesortering eller magnetisk aktiveret celle sortering ved hjælp af LS-kolonne til positivt at vælge CD44 positive celler. Da de ønskede celler tillægger væggene i LS-kolonnen, skal du kassere flowthrough, derefter fjerne celler fra kolonnen, anvende fem milliliter buffer og anvende og trykke stemplet leveres med kolonnen til at skylle de ønskede celler.

Derefter skal du bruge en LD-kolonne til yderligere at rense befolkningen ved negativ udvælgelse. Her knyttes cd24-positive celler til LD-kolonnerne. Indsaml gennemløbet, som indeholder de negative CD24-celler. Dernæst bekræfter brugen af flowcytometri fænotyperne for alle isolerede celler. Ved hjælp af trypan blå udelukkelse metode, beregne tætheden af levedygtige celler.

Efter passende fortynding af celleaffjedringen, frø hver brønd af en seks godt ultralow fastgørelse plade med 500 til 4.000 celler per centimeter kvadrat i 2 milliliter komplet mammosphere medium. Inkubat pladerne, der sørger for ikke at forstyrre dem i 5 til 10 dage, indtil kuglerne er observeret. Fortsæt dyrkningen, indtil kuglerne var mindst 40 mikron i diameter, men er endnu ikke begyndt at blive apptotiske.