Selenoprotein O에 대한 기질 결합을 프로브하기 위해 Thermal Shift Assay를 활용
Summary
여기에서는 관심 단백질에 대한 소분자의 결합을 조사하는 데 사용되는 고처리량 형광 기반 기술인 열 이동 분석을 제시합니다.
Abstract
알려지지 않은 기능을 가진 단백질의 생물학적 중요성을 정의하는 것은 세포 과정을 이해하는 데 상당한 장애물이 됩니다. 생물정보학 및 구조적 예측이 미지의 단백질 연구에 기여했지만, 체외 실험 검증은 생화학적 활성에 필요한 최적의 조건과 보조 인자로 인해 종종 방해를 받습니다. 보조인자 결합은 일부 효소의 활성에 필수적일 뿐만 아니라 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수도 있습니다. 이 현상의 한 가지 실제 응용 분야는 단백질의 용융 온도 변화에 의해 측정된 열 안정성의 변화를 활용하여 리간드 결합을 조사하는 데 있습니다.
열 이동 분석(TSA)은 관심 단백질에 대한 다양한 리간드의 결합을 분석하거나 X선 결정학과 같은 실험을 수행하기 위한 안정화 조건을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 금속 및 뉴클레오티드 결합을 테스트하기 위한 간단하고 고처리량 방법을 위해 pseudokinase인 Selenoprotein O(SelO)를 사용하는 TSA용 프로토콜에 대해 설명합니다. 표준 키나아제와 달리 SelO는 ATP를 역방향으로 결합하여 단백질 AMPylation으로 알려진 번역 후 변형(posttranslational modification)에서 AMP가 단백질의 하이드록실 곁사슬로 전달되는 것을 촉매합니다. 용융 온도의 변화를 활용하여 SelO 기능의 기저에 있는 분자 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.
Introduction
인간 단백질체의 대부분은 제대로 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. Dunham과 Kustatscher et al.에 의해 기술된 “가로등 효과”는 광대하게 연구된 단백질이 더 많은 주목을 받고, 충분히 연구되지 않은 단백질은 간과되는 현상을 말합니다 1,2. 이 효과에 기여하는 요인에는 특정 단백질의 생물학적 중요성 및 질병 관련성이 포함됩니다. 또한, 기능 분석을 위한 도구의 가용성뿐만 아니라 기초 지식을 제공하는 선행 연구는 고도로 연구된 단백질 1,2에 대한 연구를 더욱 자극합니다. Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium 및 Enzyme Function Initiative와 같은 프로젝트는 구조 및 기능 단백질체학을 사용하여 연구가 부족한 단백질을 특성화하는 것을 목표로합니다 2,3,4. 연구가 부족한 단백질의 분자 기능을 식별하기 위한 보완적인 접근법은 이러한 단백질과 작은 분자의 상호 작용을 조사하여 조절 및 기질 특이성에 대한 귀중한 통찰력을 얻는 것입니다.
작은 분자의 결합은 단백질의 열 안정성을 증가시킬 수 있다5. 리간드 유도 형태 안정화(ligand-induced conformation stabilization)로 알려진 이 현상은 종종 단백질의 용융 온도를 증가시켜 리간드 결합의 측정 가능한 지표를 제공합니다6. 단백질의 열적 안정성은 Thermofluor 또는 TSA(Thermal Shift Assay)라고도 하는 DSF(Differential Scanning Fluorimetry)를 사용하여 측정할 수 있습니다7,8,9,10. TSA에서 단백질 샘플은 환경적으로 민감한 염료가 있는 상태에서 온도가 상승합니다6. 단백질이 풀리고 변성됨에 따라 염료는 단백질의 노출된 소수성 영역에 결합하고 형광을 방출합니다. 외부 형광 염료 또는 환경에 민감한 염료는 고유 형광이 부족하고 대신 표적 분자9,11,12와 상호 작용할 때 형광을 발합니다. 가장 일반적으로 사용되는 염료인 SYPRO Orange는 향상된 안정성 및 최소 배경 형광 8,9,12와 같은 여러 가지 이점을 제공합니다. 특히 SYPRO Orange는 각각 약 470nm 및 570nm의 여기 및 방출 파장을 감안할 때 Real-Time Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) 시스템과 호환됩니다. 이 고유한 기능을 통해 RT-PCR 시스템8에서 일반적으로 사용되는 형광 검출 시스템과 호환되는 고처리량, 정확하고 감도 높은 측정이 가능합니다.
TSA는 단백질과 잠재적 보조 인자 또는 약물의 상호 작용을 조사하고 결정학을 위한 안정화 조건을 식별하기 위한 다목적 도구입니다. 다른 스크리닝 방법에 비해 장점 중 일부는 설정이 상대적으로 간단하고 96웰 또는 384웰 플레이트(13,14,15)를 사용한 높은 처리량입니다. 이 기술의 개발은 약물 발견 연구에 혁신을 일으켜 편의성을 제공하고 이온, 리간드 및 약물과 같은 다양한 첨가제의 연구를 가능하게 했습니다 6,16. 더욱이, TSA의 적응성은 과학자들이 그 유용성을 확장하도록 장려하여 스크리닝 분석(17,18)과 함께 결합 친화도의 측정을 용이하게 했습니다. TSA는 결정화에 대한 관심 단백질의 안정화를 촉진하는 조건을 식별하기 위한 구조 생물학 연구에서 효과적인 도구입니다19. 따라서 TSA의 유연성과 상대적 용이성은 단백질을 특성화하는 데 있어 초석 기법으로 자리매김했습니다. 여기에서는 TSA를 사용하여 연구가 부족한 슈도키나아제인 Selenoprotein O(SelO)에 대한 금속 및 뉴클레오티드의 결합을 분석합니다.
키나아제(kinase)는 신약 개발20에서 가장 표적이 되는 단백질군 중 하나입니다. 인간 키나아제의 약 10%는 비활성으로 예측되며 촉매 작용에 필요한 주요 촉매 잔기가 부족하기 때문에 슈도키나아제(pseudokinase)로 명명됩니다21,22. 셀레노프로테인 O(SelO)는 촉매 HRD 모티프23에서 보존된 아스파르테이트가 결핍된 진화적으로 보존된 슈도키나아제입니다. 진핵 생물에서 SelO는 미토콘드리아에 국한되어 산화 스트레스로부터 세포를 보호합니다24,25. 구조 및 생화학적 분석에 따르면 SelO는 AMPylation25로 알려진 번역 후 변형을 통해 ATP에서 단백질 기질로 아데노신 일인산(AMP)을 전달합니다. 최근 연구에 따르면 AMPylation을 촉매하는 효소는 in vitro26,27과 같은 대체 뉴클레오티드와 결합할 수 있습니다. 특히, 연구에 따르면 Salmonella typhimurium의 SelO 상동체는 망간 의존성 방식으로 단백질 UMPylation 또는 UMP의 전달을 촉매합니다28. 이러한 흥미로운 관찰을 감안할 때, 우리는 마그네슘과 망간의 존재 하에서 SelO와 ATP 및 UTP의 결합을 테스트하며, 이는 TSA 응용 분야의 대표적인 예입니다. 다음 프로토콜은 다른 단백질 및 관심 첨가제의 상호 작용을 최적화하고 검사하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TSA(Thermal Shift Assay)는 보조인자 및 억제제와의 상호작용을 포함하여 단백질-리간드 상호작용을 스크리닝하는 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜에서는 TSA를 사용하여 뉴클레오티드 및 2가 양이온에 대한 슈도키나아제 SelO의 결합을 측정했습니다. 우리의 연구 결과는 SelO가 ATP 및 Mg2 + / Mn2 +의 존재 하에서 증가 된 열 안정성을 나타낸다는 것을 보여줍니다….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S.는 W.W. Caruth, Jr. 생물의학 연구 장학생, 텍사스 암 예방 및 연구소(CPRIT) 장학생, Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research Faculty 장학생입니다. 이 연구는 NIH Grant K01DK123194(A.S.), CPRIT Grant RR190106(A.S.), Welch(I-2046-20200401) 및 Welch(I-2046-20230405)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383-10G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Avanti J-15R with microplate carrier assembly | Beckman Coulter | C19416 | |
| CFX Opus 384 Real-time PCR system | Bio-Rad | 12011452 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3805 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | M3634-500G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| SYPRO Orange Protein Gel stain | Sigma Aldrich | S5692-500UL | |
| Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate | Sigma Aldrich | U6625-100MG | used for representative results but not required to perfom TSA |
Riferimenti
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