Quantificazione del livello di 8-oxo-dG utilizzando il test ELISA per valutare il danno ossidativo al DNA nelle cellule MCF-7

Il danno ossidativo del DNA è una conseguenza di uno squilibrio tra la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e il sistema di difesa antiossidante cellulare¹. Coinvolge principalmente l’ossidazione delle basi di DNA, purina e pirimidina ^2,3. Questa modificazione ossidativa delle basi del DNA non solo compromette l’integrità del genoma, ma comprende anche un’ampia gamma di problemi patologici, tra cui cancro, malattie neurodegenerative e malattie cardiovascolari ^4,5. La base guanina nel DNA ha il più basso potenziale di riduzione ed è la più suscettibile all’ossidazione⁶. Pertanto, l’8-oxo-7,8-diidro-2′-deossiguanosina (8-oxo-dG) funge da marcatore primario per valutare l’entità del danno ossidativo del DNA ^7,8. La quantificazione accurata dell’8-oxo-dG è diventata una questione critica nell’affrontare vari aspetti dell’insorgenza della malattia, della progressione e della valutazione del carico ossidativo multifattoriale⁹.

I metodi tradizionali per la rilevazione dell’8-oxo-dG, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni con rivelazione elettrochimica (HPLC-ECD), la spettrometria di massa e le relative tecniche di sillabazione, mostrano un’elevata sensibilità e specificità 10,11,12. Tuttavia, queste tecniche hanno spesso requisiti operativi complessi e costi elevati, che ne ostacolano l’ampia applicabilità e la praticità nell’analisi di campioni ad alto rendimento. Con il continuo progresso della scienza e della tecnologia, è emersa una varietà di metodi nuovi, efficienti e accurati. L’applicazione di queste nuove tecnologie ci permette di quantificare il livello di 8-oxo-dG in modo più accurato e fornisce strumenti più potenti per uno studio approfondito dell’associazione tra stress ossidativo e malattia. Ad esempio, i ricercatori hanno applicato la tecnologia dei nanopori per rilevare e sequenziare quantitativamente il DNA¹³, identificare i tipi di danno al DNA utilizzando una strategia di sequenziamento del codice con un solo clic¹⁴, sviluppare metodi di sequenziamento ad alto rendimento e creare biosensori basati su 8-oxoG integrando la biotina-streptavidina con ELISA¹⁵. Tra queste, l’ELISA, con i suoi riconosciuti vantaggi in termini di specificità, screening ad alto rendimento e costi, è una delle soluzioni ideali per il rilevamento di 8-oxo-dG. Pertanto, è fondamentale sviluppare un metodo ad alto rendimento, altamente sensibile, conveniente e rapido per rilevare l’8-oxo-dG.

La tecnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), sviluppata nel 1971¹⁶, è progredita rapidamente negli ultimi 50 anni ed è ora diventata uno dei metodi di rilevamento più comunemente utilizzati nei campi della biologia e della medicina 17,18,19. La tecnologia ELISA presenta un’elevata sensibilità e specificità, possiede un breve tempo di reazione ed è facile da usare, il che la rende una scelta ampiamente riconosciuta per l’analisi di campioni su larga scala e l’analisi ad alto rendimento²⁰. Di conseguenza, l’ELISA è stato ampiamente utilizzato per l’analisi quantitativa o semiquantitativa di composti, proteine, anticorpi o molecole all’interno delle cellule 21,22,23. Ad esempio, è stato utilizzato nel rilevamento di biomarcatori associati a varie malattie, residui di farmaci e biomolecole²⁴. Gli ELISA possono essere classificati in quattro tipi principali in base al disegno sperimentale e ai principi²⁵. Questi metodi includono ELISA diretto, ELISA indiretto, ELISA a sandwich ed ELISA^{competitivo 26,27}. Tra questi, per lo studio di questo articolo è stato scelto l’ELISA a sandwich, che utilizza due anticorpi specifici, uno per catturare la molecola bersaglio e l’altro per il rilevamento. Il principio sperimentale dell’ELISA a sandwich è il seguente: in primo luogo, un anticorpo specifico viene immobilizzato nei pozzetti di una micropiastra per catturare l’analita di interesse. Dopo l’aggiunta dello standard o del campione, l’analita target si lega all’anticorpo immobilizzato. Successivamente, viene aggiunto un anticorpo marcato che riconosce un epitopo diverso sull’antigene, formando una struttura a sandwich. Dopo la rimozione degli anticorpi non legati, viene aggiunto un substrato. Sotto l’azione catalitica dell’anticorpo secondario, si verifica una reazione cromatica e l’intensità del colore è correlata positivamente con la concentrazione dell’analita target nel campione. Infine, è stata misurata la densità ottica (OD) per determinare la concentrazione del campione. L’ELISA a sandwich presenta i vantaggi di una maggiore sensibilità e specificità per i campioni target, il che lo rende adatto per rilevare basse concentrazioni di analiti target e campioni complessi²⁸. Inoltre, i risultati ottenuti possono essere quantificati per ulteriori analisi. Questi fattori rendono l’ELISA a sandwich un metodo di rilevamento comunemente utilizzato sia nella ricerca scientifica che nei laboratori clinici²⁹.

Questo studio mirava a rilevare quantitativamente l’8-oxo-dG nelle cellule MCF-7 per determinare il grado di danno ossidativo del DNA nelle cellule. Questo studio si compone di due parti principali: la costruzione di un modello di danno ossidativo del DNA delle cellule MCF-7 e la rilevazione dell’8-oxo-dG mediante ELISA. In primo luogo, le cellule MCF-7 sono state coltivate in vitro e trattate con diverse concentrazioni di H₂O₂ per durate diverse. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un test CCK-8 per determinare la concentrazione inibitoria semimassimale (IC₅₀) di H₂O₂ nelle cellule MCF-7. Sulla base dei valori IC₅₀ , sono stati scelti un tempo di trattamento H₂O₂ appropriato e una concentrazione di induzione. Per estrarre campioni di cellule MCF-7 danneggiate dall’ossidazione, sono stati prelevati campioni cellulari e surnatanti e aggiunti a pozzetti legati agli enzimi precedentemente rivestiti con anticorpi 8-oxo-dG. L’8-oxo-dG presente nel campione si legherà agli anticorpi legati al vettore in fase solida. Quindi, sono stati aggiunti anticorpi 8-oxo-dG marcati con perossidasi di rafano. La miscela di reazione è stata incubata a temperatura costante per garantire il completo legame del campione e dell’anticorpo. L’enzima non legato è stato rimosso mediante lavaggio, quindi è stato aggiunto il substrato colorimetrico, che ha prodotto un colore blu. Sotto l’azione dell’acido, la soluzione è diventata gialla. Infine, il valore OD dei campioni del pozzo di reazione è stato misurato a 450 nm e la concentrazione di 8-oxo-dG nel campione era proporzionale al valore OD. Generando una curva standard, è possibile calcolare la concentrazione di 8-oxo-dG nel campione.