Trattamento sistemico per topi adulti postnatali, giovanili e runted mediante iniezione di seno retrobulbare
Summary
Questo articolo fornisce un protocollo e un video di accompagnamento per l’iniezione del seno retrobulbare fino a un volume totale di 150 μL per topi postnatali, giovani e adulti runted. Questa procedura è particolarmente adatta per l’iniezione di piccoli topi (15 g) quando l’iniezione della vena caudale non è fattibile.
Abstract
Mentre le iniezioni della vena caudale sono spesso utilizzate come via di somministrazione sistemica nei topi adulti, le iniezioni retrobulbari sono un metodo alternativo per la somministrazione sistemica con meno limitazioni. In primo luogo, le iniezioni della vena caudale (TVI) sono limitate ai topi adulti in cui la dimensione della vena caudale è adatta per l’accesso. Essere limitati al trattamento di topi adulti può essere problematico quando si ha a che fare con modelli murini che non sopravvivono fino all’età adulta. In secondo luogo, le TVI non sono fattibili per i modelli murini con fenotipi di ritardo della crescita in cui i topi non raggiungono mai le dimensioni dei topi adulti wildtype. Pertanto, le iniezioni retrobulbari possono essere utilizzate con successo per trattare sia topi giovani che piccoli adulti. Infine, le iniezioni retrobulbari vengono eseguite in anestesia, che è meno stressante per i topi rispetto alle TVI che vengono comunemente eseguite senza anestesia. Questo articolo presenta un protocollo e istruzioni dettagliate per le iniezioni retrobulbari che possono essere utilizzate per la somministrazione sistemica a topi piccoli e giovani.
Introduction
I modelli murini di malattie genetiche sono comunemente usati per dimostrare l’efficacia delle terapie a piccole molecole, genetiche e cellulari1. Nei topi, il metodo più utilizzato per replicare la somministrazione sistemica all’uomo è l’iniezione della vena caudale (TVI), che viene tipicamente eseguita nei topi adulti a circa 6-8 settimane di età per garantire che la vena sia abbastanza grande da poter accedere. La TVI è stata utilizzata con successo in numerosi studi preclinici di prova di principio di malattie genetiche, come l’emofilia, che hanno supportato gli studi clinici sull’uomo per la terapia genica2. Tuttavia, molti modelli murini di malattia genetica hanno fenotipi di crescita e/o letalità precoce, che impediscono loro di raggiungere l’età o le dimensioni di un topo adulto (Figura 1). Il trattamento di tali topi tramite TVI può essere estremamente difficile, se non impossibile, a seconda dell’età di letalità e/o delle dimensioni massime che gli animali possono raggiungere.
Al contrario, la somministrazione sistemica di un agente terapeutico mediante iniezione di seno retrobulbare (frequentemente e erroneamente indicata come retro-orbitale) può essere eseguita abbastanza facilmente nei topi, indipendentemente dall’età o dalla taglia3. Le iniezioni retrobulbari di virus adeno-associato (AAV) sono state utilizzate con successo in giovani modelli murini di malattia genetica ritardata della crescita, come l’acidemia metilmalonica (MMA) e la malattia di Niemann-Pick di tipo C 4,5,6,7,8. (Questa procedura può essere utilizzata anche per iniettare neonati 3,4,9,10; tuttavia, questa tecnica non è descritta in dettaglio in questo protocollo o nel video di accompagnamento.) Anche sostanze altamente tossiche come la doxorubicina possono essere somministrate in modo sicuro mediante iniezione retrobulbare11,12. A differenza della TVI, i topi vengono anestetizzati durante le iniezioni del seno retrobulbare, il che rende la procedura meno stressante per il topo e più facile per l’operatore che non deve trattenere fisicamente il topo13,14. Un’ulteriore preoccupazione è che la TVI utilizza spesso una lampada termica per dilatare la vena caudale, il che potrebbe potenzialmente causare disidratazione nei topi giovani e potrebbe essere problematico nei modelli murini di malattia genetica che sono più suscettibili allo stress correlato al calore. Un altro problema che può sorgere quando si utilizza la TVI è che la vena caudale può essere particolarmente difficile da visualizzare su topi altamente pigmentati. Tuttavia, come la TVI, le iniezioni di seno retrobulbare determinano un’ampia biodistribuzione sistemica15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene l’iniezione retrobulbare sia un metodo affidabile per somministrare piccole molecole, proteine e terapie genomiche, la pratica della tecnica con un colorante è necessaria per garantire che si ottenga una somministrazione sistemica affidabile e replicabile. L’uso di un colorante è altamente raccomandato per praticare iniezioni retrobulbari nei topi prima di utilizzare questa via di somministrazione negli esperimenti. I coloranti possono essere controllati visivamente nei tessuti del topo per garantire una somministrazione sistemica costante.
Nella nostra dimostrazione della tecnica di iniezione retrobulbare, il gas isoflurano è stato utilizzato per anestetizzare i topi prima della procedura. Altre forme di anestesia possono essere utilizzate prima della procedura, ma è importante assicurarsi che il topo non si riprenda dalla sedazione prima che l’iniezione sia completata. Fortunatamente, l’iniezione vera e propria di solito richiede meno di un minuto e il tempo per il quale il topo deve essere completamente anestetizzato è breve. Il topo deve essere completamente sedato durante l’iniezione e l’anestesia deve essere somministrata nuovamente se il topo diventa cosciente prima dell’iniezione. Poiché ci sono rischi associati all’uso dell’anestesia, la durata del tempo in cui il topo viene sedato dovrebbe essere ridotta al minimo. Non abbiamo avuto problemi con l’isoflurano per sedare piccoli topi malati con acidemia metilmalonica e propionica. Tuttavia, alcuni modelli murini possono essere più sensibili alla sedazione e ad alcune anestesie. Questo potenziale problema dovrebbe essere considerato prima di tentare di utilizzare la sedazione in uno studio. Infine, l’uso della sedazione in combinazione con l’iniezione retrobulbare riduce notevolmente il disagio apparente che il topo mostra durante il processo di iniezione rispetto alla TVI in cui la sedazione non è comunemente usata.
Non abbiamo osservato alcun problema correlato all’iniezione post-iniezione, sebbene l’infezione sia un potenziale rischio con qualsiasi iniezione. Per ridurre la possibilità di infezione, vengono utilizzate una siringa monouso sterile e PBS sterile per diluire l’AAV purificato. Tutti i topi nella nostra struttura per animali vengono controllati quotidianamente per segni di potenziali problemi di salute e ricevono cure veterinarie per affrontare eventuali problemi di salute quando giustificato.
L’alternativa all’iniezione del seno retrobulbare e il metodo più utilizzato per la somministrazione sistemica a topi giovani e adulti è la TVI. L’IVI e l’iniezione del seno retrobulbare determinano una biodistribuzione simile nel caso di piccole molecole e anticorpi e, per estrapolazione, lo stesso ci si aspetterebbe per i vettori virali15,16. Tuttavia, in letteratura non è stato possibile trovare esempi che confrontino la somministrazione sistemica di vettori di terapia genica mediante TVI e iniezione di seno retrobulbare. A nostro avviso, le iniezioni del seno retrobulbare sono più facili da eseguire nei topi con un fenotipo di crescita ridotto e/o letalità precoce.
La TVI è spesso considerata più analoga alla somministrazione sistemica nell’uomo, nonostante gli esseri umani abbiano un seno retrobulbare ma non abbiano una coda. Da un certo punto di vista, l’iniezione del seno retrobulbare è simile alla somministrazione sistemica umana in quanto l’iniettore entra nel sistema venoso superiore come se un iniettore fosse somministrato a un essere umano da un catetere centrale inserito perifericamente (linea PICC) o da un catetere endovenoso posizionato nel braccio. Al contrario, l’iniettore entra nel sistema venoso inferiore di un topo dopo l’iniezione della vena caudale. Sfortunatamente, nessuno di questi metodi replica esattamente i metodi utilizzati per la somministrazione sistemica negli esseri umani, ma entrambi sono metodi efficaci di somministrazione sistemica nei topi.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apprezziamo l’assistenza del personale della struttura per topi NHGRI, del laboratorio di patologia molecolare dell’NCI e in particolare di Andrew Warner. R.J.C. è supportato dal Programma di Ricerca Intramurale del NHGRI attraverso 1ZIAHG200318-16 e questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Figure 2C è stato creato con BioRender.
Materials
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Special order | alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available |
| Barrier (Filter) Tips, 20 μL size | ThermoFisher | AM12645 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Dual Prodedure Circuit | VetEquip | 921400 | alternative anesthesia method can be used |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette | Gilson | F123600 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P100 pipette | Gilson | F123615 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Hand warmers (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | to keep mouse warm while anesthesized |
| Insulin syringes, 31 G, 8 mm length, 3/10 mL capacity | Becton Dickson | 328438 | used in video; one syringe per injection |
| Isoflurane (Fluriso) | VETONE | 502017 | alternative anesthesia can be used |
| Medline Protection Plus Disposable Underpads | ThermoFisher | 23-666-062 | to place mouse on durring injection |
| Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid | ThermoFisher | 22-730-434 | for needle disposal |
| Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | To dilute AAV to desired concencentration and volume |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile) | ThermoFisher | 3451 | for diluting AAV to disire injection volume and conentration |
| Sterile gauze sponge 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Table-Top laboratory animal anesthesia system (LAAS) | VetEquip | 901806 | alternative anesthesia method can be used |
| Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | local anesthetic |
| Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller) | Any | N/A | alternative to insulin syringe used in video |
| VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link to users guide and manual |
Riferimenti
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Samelson-Jones, B. J., George, L. A. Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia. Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retrobulbar injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Chandler, R. J., et al. Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).
- Chandler, R. J., et al. Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1. Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).
- Venturoni, L. E., et al. Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing. Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).
- Ilyinskii, P. O., et al. Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).
- Davidson, C. D., et al. Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice. Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040 (2021).
- Chandler, R. J., et al. Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).
- Rocha-Ferreira, E., et al. A neonatal rodent model of retroorbital vein injection. J Vis Exp. (204), e65386 (2024).
- Bohnert, B. N., Artunc, F. Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin. J Vis Exp. (135), e57642 (2018).
- Bohnert, B. N., et al. Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study. Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).
- Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).
- Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice. J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).
- Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies. Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
.