Vorbereitung eines Mäusemodells für schwere akute Pankreatitis durch eine Kombination aus Caerulein und Lipopolysaccharid intraperitoneale Injektion
Summary
Die intraperitoneale Verabreichung von Arzneimitteln ist ein sicherer und wirksamer nicht-invasiver Ansatz zur Induktion von Pankreasverletzungen. In dieser Studie wurden fünf verschiedene intraperitoneale Injektionsprotokolle an Mäusen verglichen, um einen unterschiedlichen Grad an Pankreasschädigung zu induzieren, und ein Modell für schwere Pankreasverletzungen etabliert, um die pathologischen Veränderungen und Behandlungsstrategien für schwere akute Pankreatitis (SAP) zu untersuchen.
Abstract
Die Behandlung der schweren akuten Pankreatitis (SAP) mit hohen Mortalitätsraten stellt eine große klinische Herausforderung dar. Die Untersuchung der pathologischen Veränderungen, die mit SAP verbunden sind, anhand von Tiermodellen kann dabei helfen, potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren und neue Behandlungsansätze zu erforschen. Frühere Studien induzierten eine Pankreasschädigung primär durch retrograde Gallengangsinjektion von Natriumtaviaurocholat, aber der Einfluss der chirurgischen Schädigung auf die Qualität des Tiermodells bleibt unklar. In dieser Studie verwendeten wir verschiedene Häufigkeiten von intraperitonealen Caerulein-Injektionen in Kombination mit unterschiedlichen Dosen von LPS, um eine Pankreasschädigung bei C57BL/6J-Mäusen zu induzieren, und verglichen das Ausmaß der Schädigung über fünf intraperitoneale Injektionsprotokolle hinweg. In Bezug auf die Induktion einer akuten Pankreatitis bei Mäusen wird ein intraperitoneales Injektionsprotokoll vorgeschlagen, das innerhalb von 5 Tagen zu einer Mortalitätsrate von bis zu 80% führt. Konkret erhielten die Mäuse täglich zehn intraperitoneale Injektionen von Caerulein (50 μg/kg), gefolgt von einer Injektion von LPS (15 mg/kg) eine Stunde nach der letzten Caerulein-Verabreichung. Durch die Anpassung der Häufigkeit und Dosierung der injizierten Medikamente kann man die Schwere der Bauchspeicheldrüsenverletzung effektiv manipulieren. Dieses Modell weist eine starke Kontrollierbarkeit auf und hat einen kurzen Replikationszyklus, so dass es von einem einzelnen Forscher fertiggestellt werden kann, ohne dass teure Geräte erforderlich sind. Es simuliert bequem und genau die wichtigsten Krankheitsmerkmale, die bei menschlicher SAP beobachtet werden, und weist gleichzeitig ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit auf.
Introduction
Die schwere akute Pankreatitis ist gekennzeichnet durch einen raschen Beginn, ein rasches Fortschreiten und hohe Mortalitätsraten innerhalb des Krankheitsbereichs1 des Verdauungssystems. Die hohe Sterblichkeitsrate stand seit jeher im Mittelpunkt der klinischen Forschung. Aufgrund unvorhersehbarer Veränderungen der klinischen Bedingungen, der Heterogenität der Krankheitsmanifestationen und der begrenzten Verfügbarkeit menschlicher Proben ist die Etablierung von Tiermodellen für die Krankheitsforschung immer wichtiger geworden.
Die retrograde Injektion von Natriumtaurocholat in den Gallengang communis wird häufig verwendet, um ein Rattenmodell von SAP2 zu erstellen. Durch die Simulation einer pankreatikobiliären Obstruktion und die Induktion des Rückflusses von Galle und Pankreasflüssigkeit zeigt diese Modellierungstechnik eine hohe Erfolgsquote bei der Replikation von SAP-Tiermodellen. Es ist jedoch zu beachten, dass die invasive Chirurgie Auswirkungen auf das Tiermodell selbst hat. Darüber hinaus ist diese Methode auf größere Tiere, wie Ratten und Hunde, beschränkt, die in erster Linie als Versuchspersonen verwendet werden. Alternative Techniken, einschließlich der Duodenalintubation3, der direkten Duodenalpunktion4 und der direkten Punktion des Gallengangs-Pankreasgangs5, werden häufig zu Modellierungszwecken verwendet.
Intraperitoneale Injektions- und diätetische Modellierungsmethoden bieten nicht-invasive Vorteile, die auf Tiere jeder Größe angewendet werden können. Das Mausmodell der SAP, das durch die Fütterung von Cholin-defizientem Ethionin (CDE)6 induziert wird, weist bestimmte Komplikationen auf, wie z. B. schlecht kontrollierbare Hyperglykämie und Hypokalzämie, was es für die Bewertung neuer diagnostischer und therapeutischer Ansätze ungeeignet macht. Auf der anderen Seite stellt die intraperitoneale Injektion von Caerulein in Kombination mit L-Arginin7 die am häufigsten eingesetzte Methode zur Induktion einer akuten Pankreatitis bei Mäusen dar. Insbesondere die wiederholte intraperitoneale Verabreichung von Caerulein – einem Cholecystokinin-Analogon – bietet einen sehr geeigneten Ansatz zur Untersuchung verschiedener Aspekte im Zusammenhang mit dieser destruktiven Krankheit, einschließlich Pathogenese, Entzündung und Regenerationsprozessen. Aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit mit Cholecystokinin (CCK) stimuliert Caerulein effektiv die Kontraktion der Gallenblase und die Enzymsekretion der Bauchspeicheldrüse, was zu einem Ungleichgewicht in der Enzymsekretion führt, gefolgt von einer anschließenden Selbstzerstörung8. Lipopolysaccharid (LPS), das als pathogenassoziiertes molekulares Mustermolekül allgegenwärtig ist und umfassend untersucht wurde, kann durch intraperitoneale Injektion mit Caerulein kombiniert werden, um ein effektives Mausmodell für SAP zu etablieren. Diese Kombination löst schnell eine beträchtliche Anzahl von entzündlichen Zytokinen aus und setzt diese frei, was zu einer übermäßigen lokalen und systemischen Entzündung führt. Mehrere Studien haben über die Induktion von SAP-Modellen bei Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Caerulein in Kombination mit LPS berichtet. Dies kann auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass die intraperitoneale Injektion von Caerulein bei Mäusen Pankreasödeme und Blutungen verursachen kann, während die Zugabe von LPS sofort eine Pankreasnekrose induzieren und die systemische Entzündungsreaktion, Sepsis und sogar Organversagen verschlimmern kann. Derzeit gibt es Schwankungen in der Dosierung und Häufigkeit von intraperitonealen Caerulein-Injektionen sowie Inkonsistenzen bei der zusätzlichen LPS-Dosierung. Das Erreichen von Konsistenz in Maus-SAP-Modellen ist eine Herausforderung 9,10,11,12; Daher ist es notwendig, ein standardisiertes Protokoll zu erstellen, um ein ideales Modell zu erhalten. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die intraperitoneale Injektion bei Mäusen und untersuchen die optimale Injektionshäufigkeit und zusätzliche Dosierung von LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Derzeit fehlt es an wirksamen Mitteln, um die hohe Sterblichkeitsrate bei Patienten mit schwerer akuter Pankreatitis zu verbessern. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Wirksamkeit von Medikamenten bei der Verbesserung der Immunstabilitätsmechanismen zu untersuchen. Es besteht ein dringender Bedarf an einem idealen Tiermodell für eine schwere akute Pankreatitis. Mäuse mit einem genetischen Hintergrund von C57BL/6J werden häufig in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, einschließlich Studien zur SAP-Pathophy…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt von Research Projects in Health and Medical Science in der Stadt Huainan (Nr. HNWJ2023005); Kommunales Leitprogramm für Wissenschafts- und Technologiepläne in der Stadt Huainan (Nr. 2023151); Schulungsprogramm für Studenten des Anhui Provincial College für Innovation und Unternehmertum (Nr. S202310361254); Die neunte Charge der “50· Stars of Science and Technology” in der Stadt Huainan und dem Key Clinical Specialty Construction Project der Provinz Anhui. Wir möchten uns bei der Laborabteilung des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Anhui University of Science and Technology für die Bereitstellung der relevanten Testdaten bedanken.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
Riferimenti
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