Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly <i>Bradysia (Sciara) coprophila</i>: A New/Old Emerging Model Organism

Susan  A. Gerbi

doi:10.3791/66751

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biologia

תחזוקת מעבדה של זבוב הדיפטרן התחתון Bradysia (Sciara) coprophila: אורגניזם מודל מתפתח חדש/ישן

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66751

Susan A. Gerbi

¹Department of Molecular and Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Summary

מאמר זה מתאר את תחזוקת המעבדה (כולל הזדווגות והאכלה) של זבוב הדיפטרן התחתון Bradysia (Sciara) coprophila.

Abstract

מלאי מעבדה של זבוב הדיפטרן התחתון, Bradysia (Sciara) coprophila, נשמר במשך יותר ממאה שנה. פרוטוקולים לתחזוקת מעבדה של B. coprophila מוצגים כאן. פרוטוקולים אלה יהיו שימושיים עבור המספר הגדל במהירות של מעבדות החוקרות B. coprophila לנצל את התכונות הביולוגיות הייחודיות שלו, הכוללות (1) ציר מונופולרי במיוזה הגברית I; (2) אי-ניתוק של הדיאדה X במיוזה הגברית II; (3) הטבעה כרומוזומלית כדי להבדיל בין הומולוגים אימהיים לאבהיים; (4) כרומוזומים מוגבלי קו נבט (L); (5) חיסול כרומוזומים (כרומוזומים אבהיים במיוזה הגברית I; כרומוזומי X אחד או שניים בעוברים מוקדמים; כרומוזומי L מהסומה בעוברים מוקדמים); (6) קביעת מין על ידי האם (אין כרומוזום Y); ו-(7) הגברת DNA מווסתת התפתחותית במוקדי נשיפה של DNA בכרומוזומי פוליטן של בלוטת הרוק הזחלית.

כיום ניתן לחקור תכונות ייחודיות רבות אלה של מכניקת הכרומוזומים באמצעות ההתקדמות האחרונה בריצוף והרכבה של גנום B. coprophila ופיתוח מתודולוגיית טרנספורמציה להנדסה גנומית. הקהילה המדעית ההולכת וגדלה המשתמשת ב-B. coprophila למחקר תפיק תועלת מהפרוטוקולים המתוארים כאן להזדווגות הזבובים (סמנים פנוטיפיים לאימהות שיהיו להן רק בנים או רק בנות; פרטים על הזדווגות המונית לניסויים ביוכימיים), בדיקת בקיעת עוברים, האכלת זחלים והערות אחרות על גידולו.

Introduction

הבנה מלאה של עקרונות ביולוגיים דורשת מחקר של אורגניזמים רבים ומגוונים המשתרעים על פני עץ החיים. אף על פי שמגוון רחב של אורגניזמים תוארו עד סוף המאה^ה-19 , באמצע המאה^ה-20 הוגבלו המחקרים הניסיוניים לקומץ של פחות מתריסר אורגניזמים לדוגמה. עם כניסתו של העידן הגנומי והמטרה לרצף גנומים מכל המינים בעץ החיים¹, אנו נמצאים כעת בעמדה להרחיב את סוגי האורגניזמים המשמשים לניסויי מעבדה ולקצור את היתרון של המגוון שלהם. התרחבות כזו של אורגניזמים מודל מתפתחים לניסויים יש תנאי מוקדם של היכולת לשמור אותם במעבדה. כאן, מתוארים פרוטוקולים לגידול אורגניזם מודל חדש/ישן מתפתח כזה.

רוב בעלי החיים על פני כדור הארץ מתוארים על ידי ארבע קרינות-על של חרקים². בתוך החרקים ישנם כ-158,000 מינים של דיפטרה (זבובים אמיתיים)³, עם כ-3,000 מינים במשפחת הפטרייה השחורה (Sciaridae)⁴. זבוב הפירות דרוזופילה הוא הנחקר ביותר מבין זבובי הדיפטרן. זבוב הדיפטרן התחתון (Nematocera), Bradysia (שנקרא בעבר Sciara) coprophila, התפצל לפני 200 מיליון שנה מדרוזופילה, שהוא זבוב “דיפטרן גבוה” (Brachycera). לכן, B. coprophila נמצא בעמדה טקסונומית חיובית עבור מחקרים השוואתיים עם D. melanogaster (איור 1). יתר על כן, B. coprophila יש תכונות ביולוגיות ייחודיות רבות כי הם ראויים למחקר בפני עצמם ^5,6,7. רבות מתכונות אלה אינן מצייתות לכלל קביעות הדנ”א שבו לכל תאי האורגניזם יש אותה תכולת דנ”א. ב- B. coprophila, (i) הגנום האבהי מסולק על ציר מונופולרי במיוזה הגברית I; (ii) יש אי-ניתוק של הדיאדה X במיוזה הגברית II; (iii) כרומוזומים מוגבלי קו נבט (L) מסולקים מהסומה; ו-(iv) כרומוזום X אחד או שניים מסולקים בעובר המוקדם, בהתאם למין האדם. הטבעה של כרומוזומים כדי להבדיל בין הומולוגים אימהיים לאבהיים התגלתה לראשונה ב-B. coprophila והיא משמשת לרבים מאירועי חיסול הכרומוזומים הללו. בנוסף לסילוק כרומוזומים, מעקף נוסף של קביעות הדנ”א מתרחש באמצעות הגברת DNA מווסתת התפתחותית, ספציפית ללוקוס במוקדי נשיפה של DNA בכרומוזומי פוליטן של בלוטת הרוק של הזחל. מחקרים של תכונות ייחודיות אלה דורשים תחזוקה מעבדתית של B.coprophila; פרטים על גידולו מוצגים כאן כדי להקל על מחקרים כאלה.

איור 1: פילוגנזה של Bradysia (Sciara) coprophila. אורגניזמים מודל פופולריים מסומנים בגופן כחול והסדר הטקסונומי שלהם בגופן אדום. ברדיזיה ושאר זבובי פטרייה סיאריים, כמו גם יתושים, הם זבובי דיפטרן נמוכים יותר (לשעבר, תת-סדר נמטוקרה), בעוד שמיני דרוזופילה הם זבובי דיפטרן גבוהים יותר (Suborder: Brachysera). המידע בצד שמאל של האיור הוא מ Misof et ^al.33; המידע בצד ימין הוא מ Bertone et ^al.34 ו Wiegmann et ^al.2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בעבר, הסוג Sciara היה בעל המספר הגדול ביותר (700) של מינים עבור כל eukaryote, מה שגרם לסטפן לחלק אותם⁸. לאחר מכן, הציע שין לחלק את משפחת Sciaridae לתת-המשפחה Sciarinae (עם שישה סוגים הכוללים את Sciara, Trichosia ו-Leptosciarella), תת-המשפחה Megalosphyinae (כולל הסוג Bradysia) ושלוש קבוצות נוספות (כולל Pseudolycoriella)⁹. הפילוגנזה של Sciaridae נחקרה עוד יותר על ידי מספר קבוצות בשנים האחרונות ^9,10,11. במהלך העשורים האחרונים, שמותיהם של אורגניזמים רבים במשפחת Sciaridae השתנו¹². אף על פי שרוב הספרות המשתרעת על פני יותר ממאה שנה מתייחסת לאורגניזם שאנו חוקרים בשם Sciara coprophila, שמו הטקסונומי הנוכחי הוא כיום Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola ומילים נרדפות אחרות)¹⁰. הם נמצאים ברחבי העולם וידועים בכינוי מכרסמים פטרייתיים מכיוון שהם אוכלים פטריות ופטריות אחרות. הם תוארו לראשונה בשנת 1804 על ידי מייגן¹³ באירופה ולאחר מכן על ידי יוהנסן ^14,15 בצפון אמריקה. B. coprophila נאסף במעבדת קולד ספרינג הארבור ומלאי מעבדה הוקם על ידי צ’ארלס מץ בתחילת 1900 כאשר הוא היה סטודנט לתואר שני באוניברסיטת קולומביה עם תומאס האנט מורגן. לפיכך, המניות הנוכחיות משקפות מאה שנים של רבייה. באופן דומה, הביולוגיה של B. coprophila הובהרה עוד יותר על ידי עשרות שנים של מחקרים ציטוגנטיים על ידי הלן קרוס (שעשתה את עבודת הדוקטורט שלה עם ברברה מקלינטוק).

בשנות ה-30 של המאה ה-20, Bradysia (Sciara) התחרתה עם Drosophila melanogaster כמערכת מודל למחקרים גנטיים. למרות תכונותיו הביולוגיות הייחודיות הרבות, B. coprophila הועלה על ידי D. melanogaster כאורגניזם מודל פופולרי מכיוון שמוטציות פנוטיפיות המושרות על ידי קרינה היו נחוצות למחקרים גנטיים והיו קלות יותר להשגה באחרון, למרות ש– B. coprophila עמיד רק מעט יותר לקרינת גמא מאשר D. melanogaster¹⁶. בעידן המודרני של הגנומיקה, זה כבר לא מדאיג. מכיוון שרצף הגנום 17,18,19 (אורבן, ג’רבי וספרדלינג, הנתונים לא מוצגים) ושיטות לשינוי ^20,21 (ימאמוטו וג’רבי, הנתונים לא מוצגים) עבור B. coprophila הפכו לאחרונה לזמינים, הגיע הזמן להשתמש בו כמערכת מודל מתפתחת חדשה/ישנה, כפי שרואים אותה הקהילה ההולכת וגדלה של מדענים שאימצו אותה למחקרם. מאמר זה מתאר נהלים לתחזוקת המעבדה שלה.

B. coprophila חסר כרומוזום Y, ואת המין של הצאצא נקבע על ידי האם. לנקבות שיש להן כרומוזום X (“X-prime”) עם היפוך פרצנטרי ארוך יהיו רק בנות, בעוד שלנקבות הומוזיגוטיות עבור כרומוזום X סטנדרטי (לא הפוך) יהיו רק בנים⁵ (איור 2). מידע על רצף זמין עבור כרומוזום X¹⁹, אך המנגנון המולקולרי עדיין לא הובהר כיצד כרומוזום X קובע שהצאצאים יהיו נקבות. לזכרים לעולם אין כרומוזום X, ולאחר ההפריה, הנקבות הן X’X (הטרוזיגוטיות עבור X’) או XX. ניתן להבדיל בין נקבות X’X בוגרות לנקבות XX באמצעות סמנים פנוטיפיים על הכנף (איור 3). נקבות X’X (שיהיו להן רק בנות) יכולות להיות מזוהות על ידי סמן הכנף הגלי (W) הדומיננטי על ה-X (כמו במלאי HoLo2)²². לחלופין, נקבות XX (שיהיו להן רק בנים) יכולות להיות מזוהות על ידי סמן כנף פטיט רצסיבי (p) על ה-X כמו ב-91S סטוק²³. במקרה זה, לנקבות X’Xp יהיו כנפיים באורך מלא (לא קטנות) ויהיו להן רק בנות. סטוק 6980 נושא סמן רצסיבי על כרומוזום X עבור ורידים נפוחים (sw)²⁴, כמו גם את הסמן הדומיננטי גלי על X’, המאפשר שני סמנים לבחירה עבור צלבים. מידת הביטוי של גלי יכולה להשתנות ונראית חלשה יותר בבקבוקונים צפופים שבהם המזון מגביל או אם הטמפרטורה מתחממת מדי. פנוטיפ הכנף הגלי חזק במיוחד אם הזחלים נשמרים בחדר הקר (4°-8°C) במקום 21°C הרגיל. למרות שסמן הכנף הקטנה הרצסיבי אינו משתנה וקל מאוד לזהותו, מניות 91S משמשות בתדירות נמוכה יותר מכיוון שהן פחות בריאות ממניות HoLo2. תוכניות ההזדווגות של B. coprophila מוצגות כאן (איור 2), ומתוארות בפירוט עבור מניות HoLo2, 7298 ו-W14 (קובץ משלים 1), מלאי 91S (קובץ משלים 1), מלאי 6980 (קובץ משלים 1) ומניות הטרנסלוקציה (קובץ משלים 1). מניות הטרנסלוקציה אינן קיימות עוד; הם היו טרנסלוקציות הדדיות של הטרוכרומרים (H1, H2 ו-H3) על הזרוע הקצרה של ה-X המכילה את הגנים הריבוזומליים RNA 25,26,27.

איור 2: סכמת הזדווגות עבור B. coprophila. לאורגניזם זה אין כרומוזום Y (לסומה הזכר יש X יחיד); אמהות קובעות את מין צאצאיהן. לאימהות XX יש רק בנים ולנקבות X’X יש רק בנות. לכרומוזום X יש היפוך פרצנטרי ארוך בהשוואה לכרומוזום X. השושלת האבהית או האימהית של כרומוזום X (או X’) מסומנת בכחול או אדום, בהתאמה, באיור זה. הזרע הוא הפלואידי עבור האוטוזומים, אך יש לו שני עותקים של כרומוזום X עקב אי ניתוק במיוזה II. השושלת הסומטית של עוברים מוקדמים מבטלת עותק אחד או שניים של X שמקורו באבהות אם הם יהיו נקביים או זכרים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: פנוטיפים כנפיים של B. coprophila. נקבות זבובים בוגרות מוצגות עם פנוטיפים שונים של כנפיים: (A) כנף ישרה (XX), (B) כנף גלית (_X’WX), (C) פנוטיפ כנף גלית קיצונית (_X’WX) בעלת מראה מצומק לאחר אחסון זחליםב-roo m הקר, (D) כנף קטנה (XpXp) דמוית שרידים, (E) כנף ישרה עם wildtype (XX) ולא ורידים נפוחים, (F) כנף ישרה עם ורידים נפוחים (XswXsw) שבה מופיעות בועות קטנות (חצים שחורים) בקצה העליון של הכנף ו/או קרוב לקצה שתי הכנפיים, (G) דוגמה קיצונית לנפיחות שבה שלפוחית (חץ לבן) מופיעה על כנף אחת או על שתיהן. לזכרים אין כרומוזום X ולכן לעולם לא יהיו להם כנפיים גליות, אך יש להם כנפיים קטנות או נפוחות במלאי 91S או 6980, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

המטרה בתחזוקת המלאי היא לבצע הצלבות כאשר מחצית הצלבים הם מאימהות מייצרות נקבות וחצי הצלבים מאימהות מייצרות זכרים כדי שיהיו מספר שווה של נקבות וגברים בוגרים בדור הבא לצלבים הבאים. עם זאת, זה כרוך גם בתכנון מכיוון שמחזור החיים של זכרים קצר יותר מאשר עבור נקבות וזכרים בוגרים מופיעים עד שבוע לפני הנקבות הבוגרות. הטבע מתאים לאסינכרוניזציה זו בין המינים בכך שהעוברים הזכרים יוצאים כזחלים 1-2 ימים לאחר הזחלים הנקביים מצלב באותו תאריך. עם זאת, כדי להבטיח שזכרים ונקבות בוגרים יהיו זמינים בו זמנית לצלבים במעבדה, ניתן להאיץ במידת מה את התפתחות הנקבה על ידי השארת בקבוקונים עם זחלים נקביים בטמפרטורת החדר במקום ב -21 מעלות צלזיוס או הצבת בקבוקונים עם זחלים זכרים בטמפרטורות מעט קרירות יותר (למשל, 16 מעלות צלזיוס). מסלול נוסף שהוא חסין יותר בפני טעויות הוא לעשות הצלבות עם אמהות יצרניות ביום שני והצלבות עם אמהות יצרניות גבריות ביום שישי של אותו שבוע. הדרך הקלה ביותר, וזה מה שאנחנו נוקטים, היא לבצע הצלבות עם אימהות מפיקות ומפיקות באותו יום בכל שבוע ולבצע הצלבות באותו יום בכל שבוע רצוף. לפי גישה זו, נקבות בוגרות מצלב בשבוע 1 יכולות להזדווג עם זכרים בוגרים שהגיחו מצלב בשבוע 2.

מחזור החיים של נקבת B. coprophila הוא 5 שבועות כאשר הוא מועלה ב 21 ° C (טבלה 1). אורך מחזור החיים שלהם הוא קצת יותר ארוך בטמפרטורות קרירות יותר או אם הם underfeeded. מחזור החיים של זכר B. coprophila הוא ~ 4-4.5 שבועות מאז שהם גורים 0.5-1 שבוע לפני הנקבות. הקצה של כל כוכב זחל מסומן על ידי נשירה של הקוטיקולה, אשר מופעלת על ידי פרץ ברמת הורמון הסטרואידים ecdysone. בניגוד ל-D. melanogaster, שיש לו שלושה כוכבי זחל, ל-B. coprophila יש ארבעה כוכבי זחל.

שלב התפתחותי	ימים לאחר ההזדווגות (dpm)	אורך הבמה (ימים)
הטלת ביצה	1-2
העובר	1-2 עד 7-8	~7 ימים
זחל
זחל בכוכבים 1, 2 ו-3	7-8 עד 16-19	~10
כוכב הזחל הרביעי לפני נקודת העין	16-19 עד 21-24	5
שלב נקודת העין הרביעי של הזחל	21-24 עד 25-28	4
פופה	25-28 עד 30-33	5
מבוגר	חי 1-2 ימים ב 21 ° C אם מזווג או חי 2-3 שבועות ב 16 ° C אם לא מזווג.

טבלה 1: מחזור החיים של נקבה B. coprophila ב 21 ° C.

B. coprophila יכול להישמר בכל מקום בטווח של 15 °C-25 °C, כאשר הפיתוח מתקדם לאט יותר בטמפרטורות קרירות יותר. חרק זה מעדיף סביבה לחה (נמצא באדמה של צמחי בית או ערוגות פטריות), ולכן אנו שומרים על עם מים deionized באינקובטור. B. coprophila ניתן לשמור בטמפרטורת החדר בקופסת לחם מתכת עם מכסה מתאים רופף המכיל מים, אבל הם נכנסים להלם חום ב 37 ° C²⁸, המהווה סכנה באקלים חם. מייקל אשבורנר ואחרים ניסו, ללא הצלחה רבה, לאחסן את D. melanogaster בקור כדי להפחית את הזמן הדרוש למלאי. לעומת זאת, יתרון גדול של B. coprophila הוא כי בקבוקונים עם זחלים בשלב בינוני ניתן לאחסן עד 3 חודשים על מדף פתוח בחדר קר (4-8 מעלות צלזיוס) עם טיפול מינימלי של האכלה רק פעם בחודש. הם מתפתחים לאט מאוד בקור עד לשלב הגלמים ויופיעו כבוגרים פוריים כאשר הבקבוקונים יוחזרו ל -21 מעלות צלזיוס. יש להניח שזה מחקה את החורף שלהם בטבע. עיכוב התפתחותי זה הנגרם על ידי קור עשוי להיות דומה לזה שנראה לאחר הקרנת גמא של זחלי B. coprophila ¹⁶ בשלב הביניים, אך עיכוב התפתחותי אינו נראה בזחלים בשלב מאוחר שעברו את נקודת האל-חזור להתקדמות ההתפתחותית הרגילה שלהם.

Protocol

הפרוטוקולים המתוארים כאן מייצגים מאה שנות ניסיון ממרכזי המניות Bradysia (Sciara) המפוקחים ברצף על ידי צ’ארלס מץ, הלן קרוס וסוזן ג’רבי, כמו גם קלט מאחרים. 1. צלבי הזדווגות יש להשתמש בנקבה בוגרת אחת ובשני זכרים בוגרים לכל בקבוקון זכוכית בקוטר 28 מ”מ. לאחר שהושגה הצלחה של 100% בזיהוי פנוטיפים של כנפיים לאימהות שיולדות רק בנות או בנים, השתמשו בשתי נקבות ושני זכרים בכל בקבוקון כדי להגדיל את מספר הזחלים/בקבוקונים. הוסיפו נקבות לכל בקבוקון לפני הוספת הזכרים שמתעוררים מהר יותר מההרדמה מאשר הנקבות.הערה: התיאור להלן מניח שיש לך CO2; לחלופין, ניתן להשתמש באתר כדי להרדים את הזבובים הבוגרים. אם אתם משתמשים באתר כדי להרדים את הזבובים הבוגרים, הדביקו פד של מגבוני מעבדה מקופלים (למשל, מגבונים) לחלק הפנימי של מכסה זכוכית עגול של צנצנת קופלין והשתמשו בטפטפת כדי להעביר אתר כלשהו מהבקבוק כדי להרטיב את כרית מגבון המעבדה (אך לא רווי ורטוב כל כך שנוזל אתר ייפול ממנו ויסתכן בטביעת הזבובים). בשלב 1.6 להלן, הניחו את כרית האתר הלחה על גבי הבקבוקון הפתוח למשך ~1 דקות עד שהמבוגרים יפסיקו לזוז. לאחר שהבוגרים הועברו לצלחת אריחי קרמיקה לבנה (המשמשים במקום כרית הזבובים הלבנה), מעת לעת (כאשר רגלי הזבובים מתחילות להתעוות) החזיקו את הפד שהורטב אתר טרי מעל (מבלי לגעת) בזבובים שעל הצלחת למשך ~ דקה אחת.אזהרה: האתר דליק ויש לאחסן אותו במכסה אדים ולא במקרר. סדרו בהישג יד מגש עם בקבוקונים של נקבות בוגרות, מגש עם זכרים בוגרים, ומגש בקבוקונים ריקים המכיל 2.2% (wt/vol) אגר. על ספסל המעבדה, הניחו פתקים עם הכיתוב “נקבה” או “זכר” ואת פנוטיפ הכנפיים של האם, כך שהבקבוקון עם הבוגרים שנבחרו לצלב ימוקם בקבוצה הנכונה, כאשר לכל הבקבוקונים בקבוצה אחת יהיו צאצאים זכריים בלבד ולכל הבקבוקונים בקבוצה השנייה יהיו צאצאים נקביים בלבד.הערה: ודא כי אין טיפות עיבוי בתוך הבקבוקון כמו המבוגרים ידבקו טיפות. אם הבקבוקונים אוחסנו בקופסת פלסטיק, הניחו את הבקבוקונים על ספסל מעבדה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות לפני השימוש כדי לאפשר לעיבוי להתאדות. הפעל את גז CO2 ואת המנורה עבור המיקרוסקופ המנתחת.הערה: מקור אור עם סיבים אופטיים מועדף מכיוון שהוא פולט פחות חום, מה שגורם לזבובים המורדמים להתעורר מהר יותר. הקש במרץ על הבקבוקון עם מבוגרים על כרית גומי, כך שהמבוגרים ייפלו לתחתית הבקבוקון ויסירו את התקע; הכנס את פיית אקדח CO2 והוסף בחזרה את התקע. לחץ על הדק הזרבובית כך ש- CO2 יזרום לתוך הבקבוקון למשך ~ דקה אחת כדי להרדים את המבוגרים. שים רגל על דוושת כף הרגל כך CO2 יזרום על משטח הזבוב הלבן ולא על פיית האקדח. שמור על דוושת הרגל מדוכאת כל הזמן שהזבובים נמצאים על משטח הזבוב הלבן (או לחילופין לחץ לסירוגין על דוושת הרגל בכל פעם שרגלי הזבובים מתחילות להתעוות). הסר את הזרבובית והתקע מהבקבוקון והפוך את הבקבוקון מעל משטח זבוב לבן תחת מיקרוסקופ מנתח. הקש על תחתית הבקבוקון ההפוך כנגד המיקרוסקופ כך שהמבוגרים ייפלו מהבקבוקון אל משטח הזבוב הלבן. בחר את המבוגרים השמנים ביותר (נסגר לאחרונה עם בטן לבנה) והשתמש במלקחיים עדינים כדי להרים בעדינות את המבוגר ברגלו האמצעית או האחורית. אין לפגוע ברגליים הקדמיות המשמשות לריקוד ההזדווגות. אל תשתמשו במבוגרים שזה עתה נסגרו וגופם לבן לחלוטין ועדיין לא הפך לשחור מכיוון שכנפיהם יהיו קצרות ולא מפותחות במלואן כך שלא ניתן יהיה להבקיע את פנוטיפ הכנפיים. עדיין ניתן להשתמש במבוגרים עם בטן רזה יותר, אם כי יש להם פוריות מופחתת. אין להשתמש במבוגרים רזים שכנפיהם מורמות אנכית מגופם, מכיוון שהם מתים. מצד שני, הסר את התקע מהבקבוקון עם אגר 2.2% (wt/vol). כשהיד אוחזת במלקחיים עם המבוגר, מקישים את המלקחיים במרץ על הקיר הפנימי העליון של הבקבוקון, כך שהמבוגר נופל לתחתית הבקבוקון. החלף את התקע בבקבוקון. חזור על שלבים 1.5-1.11 לעיל כדי להגדיר כל בקבוקון המכיל בוגרות. השתמשו במברשת צבע כדי לטאטא את הזבובים שאינם בשימוש ממשטח הזבוב הלבן בחזרה לבקבוקון האב שלהם. שים סימן ביקורת על התווית של בקבוקון האב כדי לציין שהוא שימש להזדווגות (אם כי ניתן להשתמש בו שוב במידת הצורך). לתחזוקת מלאי שגרתית, הגדירו 6-8 בקבוקונים עם אימהות יצרניות ו-6-8 בקבוקונים של אימהות יצרניות זכריות (איור 4). הגדירו מחצית מהבקבוקונים עם אמהות (או אבות) מבקבוקון בוגר אחד ואת החצי השני של הבקבוקונים החדשים באמצעות בקבוקון מבוגר אחר כדי למזער צווארי בקבוק גנטיים.לעיתים, אירוע הפרדה שגויה יניב זכר יוצא דופן בבקבוקונים המייצרים נקבות. אם לבקבוקון עם נקבות בוגרות יש זכר יוצא דופן, הסירו ומעכו כדי להרוג את הזכר. במידת האפשר, השליכו את כל הנקבות מהבקבוקון והמתינו מספר ימים עד שנקבות בוגרות נוספות יתקרבו וניתן יהיה להשתמש בהן בבטחה לצלבים.הערה: עדיף לא להשתמש בנקבות בבקבוקון זה לצלבים מכיוון שהן עשויות להזדווג עם הזכר יוצא הדופן ולא לייצר צלב פורה. לאחר שהנקבות הבוגרות נוספו לכל הבקבוקונים, חזרו על שלבים 1.5-1.11 כדי להוסיף שני זכרים בוגרים (איור 4) לכל בקבוקון שכבר מכיל נקבות זבובים. הקש על הבקבוקון עם הנקבות על כרית גומי כדי שלא יברחו כאשר שני הזכרים מתווספים ברצף.הערה: עבדו במהירות ואל תרדימו יתר על המידה את הזבובים הבוגרים מכיוון שזה יהרוג אותם. הוסף תווית לכל בקבוקון המציינת את המלאי, הצלב (עבור צאצאים נקביים או זכרים), האם האם הגיעה מבקבוקון בוגר #1 או #2, ותאריך ההזדווגות. הזן גם את המידע לעיל במחברת וציין את מספר הבקבוקונים שהוגדרו עבור כל צלב.הערה: נוח להוסיף מגבת נייר כדי להפריד את הבקבוקונים המייצרים זכר מהבקבוקונים המייצרים נקבות במגש. השאירו את הבקבוקונים ללא הפרעה על השיש למשך ~ 15 דקות כדי להיות בטוחים שהמבוגרים מתעוררים ועפים. התבוננו אם הם מזדווגים (זמן קצר מאוד אחרי שהם מתעוררים) היכן שהנקבה והזכר מכוונים אחורית לאחורית (הזכר יתפוס את האוביפוזיטור המחודד של הנקבה) (איור 4, למטה).הערה: נקבה בוגרת תקבל זכר בוגר רק פעם אחת, לכן אל תדחפו את הבקבוקונים לאחר ההזדווגות מכיוון שזה יכול להפריד את הזכר מהנקבה בזמן תהליך ההזדווגות והנקבה לא תזדווג מחדש. מניחים את המגש עם בקבוקונים מזווגים באינקובטור (למשל, 21 מעלות צלזיוס). תייג את המגש בשם המלאי (לדוגמה, HoLo2) ובשבוע של מחזור 5 השבועות (שבועות 1, 2, 3, 4 או 5).הערה: שמור את המגש עם זבובים שזה עתה הזדווגו בחלק נפרד של האינקובטור או באינקובטור אחר כתזכורת לא להאכיל את הבקבוקונים עד שהזחלים יצאו (מתואר להלן). 2. הזדווגות המונית הערה: בדרך כלל, לאם יחידנית מסוג B. coprophila יהיו 60 צאצאים בצאצאיה. כאשר נדרש מספר גדול יותר של צאצאים לניסויים, ניתן לבצע הזדווגות המונית במקום ההזדווגות החד-זוגית שתוארה לעיל. ההזדווגות ההמונית יכולה להיעשות בבקבוקוני זכוכית סטנדרטיים בקוטר 28 ס”מ כאשר האימהות ייאספו יום לאחר מכן לצורך הטלת ביצים מושרית ואיסוף עוברים. עם זאת, אם יש צורך במספר גדול יותר של זחלים, ההזדווגות ההמונית נעשית בצנצנת עם משטח גדול יותר כדי למנוע צפיפות. נקבו כמה חורים קטנים במכסה הצנצנת כדי שהזחלים יוכלו לקבל קצת אוויר לנשימה. בצע את השלבים לעיל בסעיף 1, אך השתמש במלקחיים עדינים כדי להעביר את כל האימהות היצרניות (או את כל האימהות היצרניות הזכריות) לפינה קדמית של משטח הזבוב הלבן. השתמשו ב-10-15 נקבות בוגרות שמנות ומורדמות וטאטאו קבוצה זו בעזרת מברשת צבע לתוך הבקבוקון או הצנצנת עם חורים קטנים שנוקבו במכסה.הערה: בצע את שלבים 2.1 ו- 2.2. הזדווגות המונית מהירה כדי למנוע הרדמת יתר שתמנע צלבים פוריים. בחרו 20-25 זכרים בוגרים שמנים ומורדמים והזיזו אותם בעזרת מלקחיים עדינים לפינה הקדמית של משטח הזבוב הלבן. טפחו במרץ על הבקבוקון או הצנצנת עם הנקבות על כרית גומי, כדי שלא יברחו כאשר התקע או המכסה מוסרים כדי לטאטא את אשכול הזכרים הבוגרים המורדים ממשטח הזבוב הלבן באמצעות מכחול. 3. איסוף עוברים לאחר הזדווגות המונית יום אחד (24 שעות) לאחר ההזדווגות, בצעו את השלבים 1.5-1.11 כדי להרדים את הזבובים הבוגרים (תערובת של נקבות וזכרים) ולהעבירם למשטח זבוב לבן.הערה: אוגנזה עדיין לא הושלמה כאשר הזבובים הבוגרים מזדווגים, מה שמפעיל מיוזה סופית; הביציות הבשלות מופרות על ידי זרע המאוחסן בזרע כאשר הביציות משתחררות 29. השלמת ביצית יכולה להימשך 1-2 ימים, ולכן יום אחד מותר לאחר ההזדווגות לפני הטלת ביצים. בעזרת מלקחיים עדינים, הרימו נקבה בוגרת בכנפיים והניחו אותה על צלחת פטרי בקוטר 100 מ”מ המכילה אגר בקוטר 2.2% (wt/vol), כאשר כנפיה מוכנסות לתוך האגר. חזור על שלב זה ברצף עבור כל נקבה בוגרת על משטח הזבוב הלבן. השליכו את הזכרים הבוגרים על משטח הזבוב. לאחר שכל נקבות הזבובים משופדות על האגר, גרמו להטלת ביצים על ידי לחיצה עדינה על הראש במלקחיים עד שנקבת הזבוב מבצעת תנועות דמויות התקף. לחלופין, סחטו בעדינות את בית החזה שלה. לאחר מכן היא תטיל אשכול ביצים מופרות תוך 30-60 דקות. מכסים את צלחת הפטרי במכסה שלה המורטב במגבון מעבדה ספוג מים כדי למנוע משיכה אלקטרוסטטית של הביצים למכסה. 4. בדיקת “בקיעה” של זחלים בדוק עבור “בקיעה” של הזחלים 1 שבוע לאחר ההזדווגות; הסר את התקע מהבקבוקון והשתמש במיקרוסקופ מנתח כדי להבקיע זחלים. הלסת השחורה שלהם תיפתח ותיסגר שוב ושוב והם ינועו לאט קדימה. אם יש רק כמה זחלים, כתוב “כמה” על תווית הבקבוקון, כתזכורת להאכיל את הבקבוקון פחות. בדקו כל בקבוקון במגש עם הצלב הזה והזינו את מספר הבקבוקונים עם הזחלים במחברת בטור ליד מספר הבקבוקונים שהוצבו באותה הזדווגות.הערה: ביצים צהובות עמוקות לא יתפתחו. ביצים לבנות צפויות להתפתח ויום לפני הופעת הזחלים יתפתח פיגמנט שחור (הלסת העתידית) בקצה הקדמי של הביצה. אל תטעו בעובש עם חוט להט לבן המסתיים בכדור שחור בקצהו לזחלים – העובש לא יזוז, בניגוד לזחלים הזוחלים קדימה על האגר. הוסיפו מעט קש (רק פעם אחת) לכל בקבוקון עם זחלים כדי לשלוט בלחות עודפת ולספק מקום מסתור לזחלים. העבירו את המגש לאינקובטור (למשל, 21 מעלות צלזיוס) עם מגשים של זחלים מצלבי הזדווגות של שבועות קודמים והתחילו להאכיל את הבקבוקונים בזחלים שזה עתה הגיחו (ראו בהמשך פרק על האכלה).הערה: בדרך כלל, הזחלים יהיו באשכול ליד אמם המתה והם יתחילו לאכול אותה; יש להניח שזה מעביר את השמרים ממעי האם למעי הזחלים. אתה יכול להתחיל להאכיל ביום שבו הזחלים יוצאים או בתוך 2 ימים לאחר מכן. זהירות: אם ההאכלה מתעכבת, הזחלים יאכלו זה את זה, כשבכל בקבוקון יישאר רק זחל שמן אחד! המשיכו לבדוק בקבוקונים שעדיין לא היו בהם זחלים במשך 3 ימים בשבוע. אם לא הופיעו זחלים לאחר 7-10 ימים, השליכו את הבקבוקון או אחסנו אותו לשטיפת בקבוקון. 5. הכנת האוכל הערה: כל מרכיבי המזון צריכים להיות ללא חומרי הדברה! השתמשו בכף כדי למדוד את המרכיבים הבאים לפי נפח והניחו אותם בתבנית מתכת או זכוכית (למשל, תבנית אפייה מתכתית בגודל 20X25 ס”מ): 4 חלקים קש שיבולת שועל (8 כפות), 2 חלקים אבקת פטריות שיטאקי (4 כפות), חלק אחד אבקת תרד (2 כפות), 1 חלק אבקת סרפד (2 כפות). השתמש כף כדי לערבב את החומרים היטב במחבת.הערה: לחלופין, ניתן להשתמש ב-2 חלקים של אבקת תרד בלבד או רק אבקת סרפד במקום חלק אחד מכל אחד. מכסים את המחבת בנייר אלומיניום ואוטוקלאבה במחזור יבש למשך 20-30 דקות. מצננים לטמפרטורת החדר למשך הלילה או יותר. מוציאים את נייר הכסף מהמחבת ומפרקים את תערובת המזון המעוקרת, בעזרת תנועת טחינה עם הכף ליצירת תערובת אבקתית. מוסיפים חלק אחד (2 כפות גדושות) של שמרי בירה ומערבבים היטב לתוך תערובת המזון האוטוקלאבית.הערה: שמרי הבירה אינם אוטומטיים מכיוון שזה יהרוג את השמרים. מעבירים את תערובת המזון לצנצנת סטרילית.הערה: ניתן להשתמש באותו סוג של צנצנת 240 מ”ל המשמשת להזדווגות המונית, והמתכון לעיל ימלא את הצנצנת. באופן דומה, אותו סוג של צנצנת מעוקרת צריך להיות ממולא רק בקש שהיה autoclaved במחבת מכוסה נייר כסף. 6. האכלה הערה: התאימו את כמות המזון הניתנת בהתאם לגיל ולכמות הזחלים. תן הרבה מזון לצנצנות עם זחלים רבים מהזדווגות המונית. תנו רק מעט מזון לצלחות פטרי עם זחלים שמאוחסנות לכמה ימים לצורך היערכות התפתחותית. שיטת ההזנה המתוארת להלן פותחה במעבדתו של צ’ארלס מץ 29, והיא שימשה את מעבדתו ואת הלן קרוס, סוזן ג’רבי ואחרים בהצלחה במשך מאה שנה. שטפו ידיים ושטפו היטב כדי להסיר סבון.הערה: כפפות אינן מומלצות מכיוון שהן מפחיתות את תחושת האצבעות לוויסות כמות המזון הניתנת לכל בקבוקון. אחסנו צנצנת סטרילית סגורה עם קש טחון וצנצנת סטרילית עם מזון באינקובטור (למשל, 21 מעלות צלזיוס) שם מוחזקים הזחלים. הסירו את המכסה מהצנצנת ומזגו מעט אוכל לקערה נקייה (למשל, צלחת ממתקים) לגישה נוחה יותר; החליפו את המכסה בצנצנת המכילה את שאריות המזון. שמור את הקערה הפתוחה עם מזון במגש מתכת או זכוכית קטן; זה יעכב קרדית או חרקים אחרים מזחול על קיר המגש כדי להיכנס לקערה עם מזון. הרימו מעט מזון בין האצבע השנייה והשלישית (או בין האגודל לאצבע השנייה). ביד השנייה, הסר בקבוקון מהמגש והסר את התקע, מחזיק אותו באצבעות בזמן האכלה. בדקו את הבקבוקון לגיל ומספר הזחלים והפקידו את כמות המזון המתאימה בבקבוקון על ידי סיבוב שתי האצבעות המחזיקות את המזון זו כנגד זו. בקבוקונים עם זחלים שזה עתה הגיחו רק צריכים כמה גרגרי מזון. בקבוקונים עם זחלים מבוגרים צריכים להיות שכבה דקה של מזון המכסה את החלק העליון של האגר. אם יש עובש לבן בבקבוקון, השתמשו באתנול 70% שרוסס על מגבון מעבדה כדי לנקות בדיקה מתכתית ארוכה (למשל, עם ידית עץ), הסירו את התקע והכניסו את הבדיקה הנקייה לבקבוקון כדי להקיש את התבנית על פני השטח של האגר. אם יש הרבה עובש, מערבלים את הבדיקה כדי לעטוף את התבנית סביב הבדיקה כדי להסיר אותה מהבקבוקון. אל תפריעו לחלק העליון של האגר מכיוון שהזחלים חיים שם; מוסיפים רק כמות קטנה של מזון ומחליפים את התקע בבקבוקון. נקו את הבדיקה עם מגבון מעבדה ספוג באתנול 70% לפני אחסון הבדיקה או השתמשו בה לניקוי בקבוקון אחר. לאחר שכל הבקבוקונים במגש הוזנו, החלף את המגש באינקובטור והסר את המגש הבא להאכלה כמו בשלב 6.3. לאחר סיום ההאכלה, יוצקים את שארית המזון מהקערה לצנצנת שעוקרה בעבר, מכסים את הצנצנת ומאחסנים אותה באינקובטור. 7. אוסף זחלים או גלמים על צלחות פטרי עבור מספר קטן של זחלים, השתמש בבדיקה מתכתית או מרית שניגבה עם 70% אתנול כדי לחפור לתוך השכבה העליונה של אגר בבקבוקון כדי להעביר את האגר דבק עם כמה זחלים לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ”מ חצי מלאה באגר 2.2% (wt/vol). עבור מספר גדול יותר של זחלים, הכניסו מרית לאורך הקיר בתחתית הבקבוקון כדי להקל על תקע האגר מהבקבוקון והפקידו אותו עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי ריקה. השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי למצוא את הזחלים בחלק העליון של תקע האגר ולהעביר אותם עם מלקחיים עדינים לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ”מ מלאה למחצה באגר 2.2% (wt/vol). השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי למיין את הזחלים עם מלקחיים עדינים לקבוצות באותו שלב התפתחותי.הערה: עקב אסינכרוניזציה התפתחותית קלה, יהיו מספר אשכולות שונים של זחלים ממוינים על צלחת פטרי עם אגר 2.2% (wt/vol). מוסיפים מעט מזון ומניחים את צלחת הפטרי עם הזחלים באינקובטור. הסר אותו מדי יום לתצפית במיקרוסקופ המנתח לבחירת השלב ההתפתחותי הרצוי.הערה: עבור מחקרי DNA puff, זחלי כתמי עיניים מוקדמים מתקדמים דרך שלבי 10×5, 12×6, 14×7 וקצה עין/טיפת לסת עם ~1 יום בכל אחד מהשלבים האלה 30,31. בחר גלמים שעיניהם 1/4 עד 1/2 מלאות פיגמנט כדי לקבל מיוזה I ושלבים II באשכי הגולם. 8. אחסון חדר קר של זחלים כגיבוי, החזיקו בחדר הקור כארבעה בקבוקונים של זחלים נקביים וארבעה בקבוקונים של זחלים זכרים משבועיים רצופים של הצלבות. עבור אחסון גיבוי, להאכיל זחלים כי הם בתחילת4 instar (שלב טרום eyespot) ולשים אותם במגש פתוח על מדף בחדר קר; האכילו את הבקבוקונים האלה רק פעם בחודש. הסר את 16 הבקבוקונים משבועיים רצופים של צלבי הזדווגות מהקור לאחר 2-3 חודשים (סמן זאת בלוח שנה כתזכורת); הניחו אותם באינקובטור (למשל, 21 מעלות צלזיוס) כדי להאכיל אותם בדרך כלל ולתת להם להתפתח למבוגרים לשימוש בצלבים. כאשר מוציאים את הבקבוקונים מהחדר הקר, הניחו בחדר הקר סט חדש של בקבוקונים עם זחליאינסטאר 4 מוקדמים, כך שהבקבוקונים הללו יהיו זמינים תמיד כגיבוי למלאי.הערה: הכדאיות לאחר אחסון בחדר קר לא נבדקה באופן שיטתי עבור שלבי התפתחות שונים, אך הניסיון שלנו מגלה כי אחסון קר של זחליאינסטאר 4 מוקדמים עובד היטב. 9. שטיפת בקבוקונים לאחר שהמבוגרים מתו (~ 2-3 שבועות לאחר האקלוסיה), הסר את הבקבוקונים מהאינקובטור ומקם אותם ב 60-70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להרוג את כל האורגניזמים שנותרו. הסר את תקעי הכותנה ואחסן אותם בקופסת פלסטיק. השתמש במרית כדי לגרד את תקע האגר מהבקבוקון לתוך פח אשפה. השרו את הבקבוקונים למשך הלילה או יותר כשהם שקועים במים בסיר. השתמשו במברשת מבחנה שנשמרה רק למטרה זו (מעולם לא השתמשו בה לכלים עם כימיקלים או עם סבון) וקרצפו למעלה ולמטה בבקבוקון תחת מי ברז זורמים. הניחו את הבקבוקון הנקי בצידו הפתוח בסלסלת מתכת. מלאו את הסלסלה בבקבוקונים נקיים.הערה: לעולם אל תשתמש בסבון בבקבוקונים מכיוון שכל שאריות סבון עלולות להרוג את B. coprophila. הוסיפו לסלסלה מכסה רשת תיל, ותוך כדי החזקת המכסה במקומו, הפכו את הסלסלה כדי למלא את כל הבקבוקונים במים נטולי יונים. בעודכם עדיין מחזיקים את המכסה במקומו, הפכו את הסלסלה כדי לרוקן את המים שעברו דה-יוניזציה מהבקבוקונים. יש לחזור על שטיפות המים שעברו דה-יוניזציה 4 פעמים. הניחו את הסלסלות עם בקבוקונים נקיים על מגבות נייר או על משטח רשת פתוח (למשל, עגלת מעבדה) לייבוש למשך לילה או יותר. אחסנו את הבקבוקונים היבשים במגירה.הערה: אל תתנו לבקבוקונים עם מבוגרים מתים להישאר זמן רב מדי לפני שטיפתם, מכיוון שזה עלול להזמין התפשטות של קרדית. 10. מזיגת אגר ממלאים מיכל גדול (סלסלת מתכת או מגש מתכת) בבקבוקונים נקיים ומוסיפים פקק כותנה לכל בקבוקון. עשו שימוש חוזר בתקעים שנלקחו מבקבוקונים ישנים בעת שטיפת הבקבוקונים, והשתמשו בתקעים שוב ושוב עד שהם מתפרקים ומתפרקים ויש להשליכם. לעקר את המיכל עם בקבוקונים מחובר על מחזור יבש במשך ~ 30 דקות ולתת להם להתקרר לטמפרטורת החדר כדי לאחסן אותם במיכל autoclave. שמור תמיד שני מיכלים (אחד פעיל בשימוש ואחד רזרבי) עם בקבוקונים מחוברים autoclaved בהישג יד. מניחים 11.0 גרם אבקת אגר בבקבוק 1 ליטר Erlenmeyer ומוסיפים 500 מ”ל מים מזוקקים כדי ליצור תמיסת אגר 2.2% (wt/vol) המספיקה למזיגה ~24 בקבוקונים (~21 מ”ל / בקבוקון). מערבלים את הבקבוק ומכניסים למיקרוגל.הערה: מכאן והלאה, השתמש בכפפת אוטוקלאבה עמידה בחום כדי לטפל בצלוחית. אותה תמיסת אגר 2.2% (wt/vol) ניתן לשפוך לתוך צלחות פטרי (עבור זחלים שנקטפו) או צנצנות (עבור הזדווגות המונית) אם אלה נחוצים. חממו במיקרוגל במשך דקה, הסירו את הבקבוק כדי לערבל אותו, החליפו אותו במיקרוגל וחממו אותו שוב במיקרוגל למשך דקה. חזור על פעולה זו מספר פעמים. צפו בבקבוק מבעד לדלת הזכוכית של תנור המיקרוגל. כאשר תמיסת האגר מתחילה להקציף ולרתיחה, השתמש מיד בלחצן העצירה הידני. אין לערבל את הבקבוק בשלב זה (זה יכול לרתיחה), בזהירות להסיר אותו מהתנור אל השיש ולתת לו לנוח במשך כמה דקות. הסר את התקע מבקבוקון מעוקר והחזק אותו ביד אחת; השתמש ביד השנייה כדי לשפוך ~ 2.5 ס”מ גבוה 2.2% אגר לתוך בקבוקון מעוקר. לאחר מכן, החלף את התקע בבקבוקון. חזור על פעולה זו עד שכל האגר נשפך.הערה: אם מוזגים מעט מדי אגר לתוך הבקבוקון, הוא יתייבש מהר יותר במהלך השימוש ויתכווץ מדפנות הבקבוקון. אם שופכים יותר מדי אגר לתוך הבקבוקון, קשה להתמקד בשכבה העליונה כאשר מבקיעים את “בקיעת התינוק” של הזחלים במיקרוסקופ מנתחת. תן בקבוקונים שפכו להישאר על השיש בטמפרטורת החדר במשך 1-2 ימים, כך אגר מתקשה ואת הלחות מתאדה לחלוטין. השתמש בבקבוקונים להזדווגות צלבים או לאחסן אותם שוכבים על צדם בקופסת פלסטיק עם מכסה הדוק; הניחו מגבת נייר ספוגה במים על גבי הבקבוקונים לפני הנחת המכסה על הקופסה (זה ימנע מהאגר להתייבש ולהתכווץ מדופן הבקבוקון). אחסנו את הקופסה עם בקבוקונים מוזגים בטמפרטורת החדר למשך מספר ימים או במקרר בטמפרטורה של 4°C או בחדר קר למשך עד שבועיים. לפני השימוש בבקבוקונים המאוחסנים, הוציאו אותם מהקופסה והשאירו אותם על השיש בטמפרטורת החדר למשך שעה-שעתיים כדי לאפשר לעיבוי להתאדות מתוך הבקבוקונים (הזבובים הבוגרים היו נדבקים לעיבוי וטובעים). 11. ביצוע תקעים לבקבוקונים מניחים בקבוקון נקי במחזיק מבחנה קלקר בנפח 50 מ”ל (דוחפים את הצינורית פנימה כך שתעמוד ישר). חותכים ריבוע בד גבינה (בעובי 2-4 שכבות) ומניחים אותו על גבי הבקבוקון. הניחו שאריות של בד גבינה מתקעים שיוצרו בעבר על גבי בד הגבינה ליצירת שכבה עבה יותר. מניחים כותנה על גבי בד הגבינה ולוחצים כלפי מטה לתוך הבקבוקון, תוך הקפדה על מילוי הדוק של הסנטימטר העליון של הבקבוקון. החזיקו את החלק העליון של קצות בד הגבינה יחד וקשרו אותו בחוט. חותכים את החוט העודף ואת עודף בד גבינה (להשאיר מספיק זנבות של החוט כדי לשמור אותו קשור מספיק בד גבינה כדי לתפוס בנוחות את התקע).הערה: התאם תקעים כך שיהיו צמודים. אתה אמור להיות מסוגל למשוך אותם החוצה עם המורה והאצבע שלך בזמן שאתה מחזיק אותם ביד אחת. אם אתה מרים את הבקבוקון ליד התקע והוא נופל, הוא רופף מדי. אם הוא משמיע צליל פצפוץ חזק כאשר הוא נשלף החוצה, ייתכן שהוא הדוק מדי. אם הוא הדוק מדי או אם על הפקק יש שכבה של אגר קשה ויבש, הזבובים עלולים להיחנק. אם התקע מעט רופף מדי או מחליק במורד דפנות הבקבוקון, ניתן להקיש עליו על השיש כדי למעוך אותו לגודל מעט רחב יותר. 12. לוח זמנים שבועי טיפוסי (ליעילות מרבית, בצע משימות בסדר הרשום) יום שני (~ 30 דקות)להאכיל בקבוקונים עם זחלים. יוצקים אגר לתוך בקבוקונים נקיים סטריליים עם תקעים. יום רביעי (~ 2 שעות)מניחים בקבוקונים עם מבוגרים מתים בתנור למשך שעה ומאחסנים לכביסה. בדוק את הזחלים “בייבי-בוקע”. להאכיל בקבוקונים עם זחלים. בצעו הצלבות הזדווגות שבועיות. תפקידים נוספים לפי הצורך: בקבוקונים נקיים עם תקעים כדי שיהיה מלאי רזרבה לפי הצורך; להכין מזון חדש וקש אוטוקלאבי לפי הצורך; צנצנות אוטוקלאביות לפי הצורך למזון וקש. יום שישי (~ 30 דקות)בדוק את הזחלים “בייבי-בוקע”. להאכיל בקבוקונים עם זחלים.

Representative Results

הפרוטוקולים המתוארים כאן הובילו להצלחה מוכחת בגידול B. coprophila. כאשר בוגרים שמנים שנסגרו לאחרונה נבחרים להזדווגות (איור 4), יותר מ-90% מהצלבים יכולים להיות פוריים ולהניב צאצאים. הצלחת הפוריות משתנה בין מניות שונות (טבלה 2). סטוק 7298 (כרומוזום X עם סמן גלי) היה הבריא ביותר מבין המניות אך עבר תקופה של ירידה, ככל הנראה בשל הפעלת אלמנטים ניידים של DNA שיצרו סידור מחדש של הגנום32. מניית HoLo2 מייצגת זן בריא שמקורו ב-7298, שם ככל הנראה התייצבו סידורי הגנום, והוא החליף את מלאי האב 7298 במרכז המניות. מלאי HoLo2 הוא זה ששימש לריצוף הגנום של B. coprophila והוא זה שנמצא בשימוש הנרחב ביותר על ידי קבוצות מעבדה שונות. לאחרונה, מוטגנזה CRISPR של זבובי HoLo2 שימשה ליצירת מלאי W14 עם פנוטיפ עין לבנה שישמש לשינוי עם סמני עיניים פלואורסצנטיים (ימאמוטו וג’רבי, הנתונים לא מוצגים). זן W14 חזק במיוחד. מניית ה-6980 (כנף גלית וסמני ורידים נפוחים) מעט פחות חזקה ומניית ה-91S (סמן כנף קטנה) חזקה עוד פחות. הצלבות מוצלחות יוצרות עוברים (איור 5). עוברים עוברים חיסול של כרומוזומי X האבהיים המוטבעים בחלוקתהמחשוף 7 עד 9. בנוסף, כרומוזומי L מוגבלים בקו הנבט מסולקים מהשושלת הסומטית בעוברים בחלוקת המחשוף ה-5 עד ה-6. העוברים מופיעים כזחלים, שאין לבלבל אותם עם עובש שגם הוא עשוי להיות נוכח (איור 6). כתמי עיניים (אנלאז’ לעיניים הבוגרות) מופיעים במחצית השנייה של כוכב הזחלהרביעי (איור 7). גודל כתמי העיניים מספק סמן פנוטיפי נוח להתחלה ולהתקדמות של הגברת נשיפה של DNA, שהיא אחת משתי דוגמאות ידועות בלבד להגברה טבעית של DNA תוך-כרומוזומלי ספציפי לאתר (גן) מווסת התפתחותית. לאחר מכן, הגלמים מתפתחים, וכמות הפיגמנט הממלאת את עיניהם יכולה לשמש סמן התפתחותי למיוזה I ו-II בזרע (איור 8) עם התנהגויות הכרומוזומים הייחודיות שלו בחטיבות אלה. איור 4: הזדווגות של זבובי B. coprophila בוגרים. הפאנל העליון מציג את שלושת סוגי הזבובים הבוגרים במלאי HoLo2: אמהות מייצרות נקבות עם כנפיים גליות (X’WX נקבות בוגרות), אמהות מייצרות זכרים עם כנפיים ישרות (XX נקבות בוגרות), וזכרים עם כנפיים ישרות (X0 זכרים בוגרים). שימו לב לאוביפוזיטור המחודד בקצה האחורי של נקבת הזבובים ולקלספר בצורת קרס בקצה האחורי של הזבובים הזכרים. הפאנל התחתון מראה הזדווגות של זכר ונקבה, כאשר הקלספר הזכר תפס את האוביפוזיטור של הנקבה. הזרע יישמר בזרע של הנקבה ויפרה את הביציות עם שחרורן החוצה. אורך הבוגרים הוא 2.0 מ”מ (זכרים), 2.5 מ”מ (נקבות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: עוברי B. coprophila . הפאנל השמאלי העליון הוא מבט על עוברים באמצעות אור סטנדרטי במיקרוסקופ מנתח; הגרעינים בציטופלסמה הסינסיטיאלית מופיעים כנקודות שחורות. הפאנל מימין משתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להמחיש את גרעיני הפרופידיום המוכתמים ביודיד של עוברים. אורכם הממוצע של העוברים הוא 200 מיקרון ורוחבם הממוצע 150 מיקרון. גרעיני תאי הנבט מתקבצים בקוטב האחורי של העובר כפי שנראה במחזורים 6 (עובר מוטה קדימה), ו-7-9, שלאחריהם הם משולבים בגרעינים סומטיים. חיסול כרומוזום L בשושלת הסומטית מתרחש בחלוקת מחשוף 5 או 6; חיסול כרומוזום X בשושלת הסומטית מתרחש בחלוקת המחשוףה-7,ה-8 אוה-9 . צלולריזציה מתרחשת במהלך שלב הביניים של מחזור 11. הטבלה משמאל מציגה את משך הזמן הממוצע עבור כל מחזור חלוקה ב- 22 °C (75 °F). השולחן משמאל והפאנל מימין מותאמים באישור דה סנט פאל וסאליבן35. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: עוברי B. coprophila מופיעים כזחלים. מקבץ עוברים (חץ כחול עבה) נראה ליד האוביפוזיטור של הנקבה הבוגרת שמתה לאחר הטלת ביצים. שבוע לאחר הטלת הביצים, העוברים הופכים לזחלים צעירים, שחלקם מסומנים על ידי החיצים השחורים. לזחלים החדשים יש לסת שחורה בקצה הקדמי וגוף שקוף. הם נעים על גבי משטח האגר ואין לבלבל אותם עם עובש שאינו זז. השיבוץ מראה מעט עובש, עם חוט להט לבן (חץ אדום) ונבג שחור בקצהו (חץ ירוק), והוא קטן מעט מאוד מהזחלים שזה עתה הופיעו. סרגל קנה מידה = 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: שלבי כתמי עיניים של זחלי B. coprophila . כתמי עיניים נוצרים בחלק הקדמי של הזחל, ממש מאחורי הלסת, והם מורכבים מגרגירי פיגמנט שמספרם גדל. כתמי העיניים הם האנלאז’ לעין הבוגרת. הפאנל העליון מראה זחלים שהודמיינו במיקרוסקופ מנתח; הלוח התחתון הוא תצוגה מוגדלת של כתמי העיניים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לדמיין זחל על מגלשת מיקרוסקופ עם טיפת מים מזוקקים וכיסוי צף קלות על גבי. המינוח של שלבי כתמי העין הוא על פי Gabrusewycz-Garcia30 שבו מספר הגרגירים נספר בשורה הארוכה ביותר (למשל, 12) ומספר השורות הנוספות למעט השורה הארוכה ביותר מצוין (למשל, 6 עבור שלב כתמי העין 12×6). התחלת הגברה של DNA ספציפי לאתר בכרומוזומי הפוליטן של בלוטת הרוק מתחילה בשלב 10×5 ומסתיימת בשעה 14×7 כאשר יש פרץ של שעתוק במיקום והתפשטות של נשיפות ה- DNA31. בשלב הבא של עין הקצה / לסת שנפלה, גרגרי כתמי העין מתחילים להתמזג, והם נעים לרוחב מקו האמצע; אורך גוף הזחל מתקצר. יתר על כן, נשיפות הדנ”א מתעבות בשלב זה. זה לוקח בערך יום אחד ב 21 ° C כדי לחצות כל שלב כתמי העין. סרגל קנה מידה = 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: התפתחות גלמי B. coprophila . במהלך הגור, כל רקמות הזחל עוברות היסטוליזה למעט מערכת העצבים ומוחלפות ברקמות בוגרות הנובעות מחטיבות תאים של הדיסקים הדמיוניים. צבע הגוף משתנה מלבן לשזוף לחום לשחור. פיגמנט בהדרגה ממלא את עין הגולם; מיוזה I ו- II מופיעות בגלמים זכרים עם עיניים בגודל 1/4 עד 1/2 מלאות בפיגמנט36. סרגל קנה מידה = 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. שם המניה סמנים שיעור הפריון הערות 7298 כנף גלית (W) ~75% HoLo2 כנף גלית (W) ~90% נגזר מ-7298 W14 כנף גלית (W); עיניים לבנות ~95% נגזר מ- HoLo2 6980 כנף גלית (W); ורידים נפוחים (SW) ~65% 91 שניות כנף גלית חלשה (W); כנפיים קטנות (P) ~50% הסמן הגלי הוצג בצלב כדי להציל 91S טבלה 2: מניות של Bradysia (Sciara) coprophila. טבלה 1 של ג’רבי6 מפרטת סמנים אלה ואחרים שאינם קיימים עוד. חמש טרנסלוקציות (T1, T23, T29, T32, T70) בקצה הצנטרומר של X27 מסוכמות באיור 8 של ג’רבי6 , אך אינן קיימות עוד. קובץ משלים 1: הצלבות HoLo2 (ו-7298 ו-W14), צלב והצלה 91S, צלב 6980, צלבי טרנסלוקציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

הפרוטוקולים המוצגים כאן לגידול של B. coprophila יהיו שימושיים עבור מדענים המעוניינים לגדל את האורגניזם הזה במעבדות שלהם לניסויים כדי להתעמק בתכונות הביולוגיות הייחודיות שלו. התיאור הראשוני של שיטת ההאכלה באמצעות אבקת שמרים ופטריות שפוזרו על בסיס אגר כדי לשמור על B. coprophila²⁹ שימש במעבדת מץ לגידול 14 מינים שונים של זבובי Sciarid⁵. לאחר מכן, נצפה כי תוספת של סרפד ו / או אבקת תרד הגבירה עוד יותר את החיוניות של B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia, תקשורת אישית). שיטות אלה נחלו הצלחה לתחזוקת מינים קרובים במשפחת Sciaridae, כולל Bradysia impatiens ו – Lycoriella ingenua הנמצאים כיום בתרבות (Robert Baird, Personal Communication).

שיטות אחרות (כגון שיטות ההזנה החלופיות המתוארות להלן) נוסו לגדל B. coprophila, אך הפרוטוקולים המתוארים כאן עברו אופטימיזציה כדי לקבל את היחס הטוב ביותר של זחלים לכל שטח פנים של אגר כדי להשיג את הבוגרים השמנים הפוריים ביותר ולמזער את צמיחת העובש. כדי להגדיל את קנה המידה, הזדווגות המונית יכולה להיעשות בבקבוקוני זכוכית כמתואר בפרוטוקול 2 לעיל. לחלופין, ניתן להניח כמה נקבות בוגרות (2-4) יחד עם פי שניים זכרים בוגרים בבקבוק כמו זה המשמש לגידול דרוזופילה (בקבוק פוליפרופילן חד פעמי 6 אונקיות = 177.4 מ”ל תחתון מרובע דרוזופילה ). בשני המקרים, על החוקר להיות בטוח לחלוטין שהבקבוק מכיל רק את כל הנקבות-המפיקה או את כל האימהות היצרניות-גבריות.

רק להאכיל את הזחלים מאז הגלמים והמבוגרים לא אוכלים. אין להאכיל את הבקבוקון אם הזחלים הפכו לגלמים (סימן לכך הוא כאשר מופיעים הזבובים הבוגרים הראשונים המוקדמים). ברגע שהמבוגרים מתקרבים, הכניסו את הבקבוקונים לאינקובטור קריר יותר (למשל, 16 מעלות צלזיוס) אם זמין, מכיוון שזה יאפשר למבוגרים לחיות זמן רב יותר. האכילו שלוש פעמים בשבוע (למשל, שני, רביעי, שישי), והגדילו את כמות המזון הניתנת לכל בקבוקון ככל שהזחלים מתבגרים. להאכיל בנדיבות, ואתה תהיה מתוגמל עם מבוגרים פוריים שמנים. עם זאת, אם אתה מאכיל יותר מדי, עובש לבן יופיע וזה סימן כדי להפחית את כמות המזון שאתה מפקיד בקבוקון. יתר על כן, אם אתה מאכיל יותר מדי, כרית עבה של מזון תתפתח על גבי האגר ותקשה על הבוגרים לצאת (אתה יכול להסיר את הפד עם מלקחיים, אבל להיזהר לא להוציא זחלים עם כרית – עדיף לא צריך לעשות את זה בכלל). בקבוקונים עם מעט זחלים (מסומנים “מעטים”) זקוקים לפחות מזון. אם אתה מאכיל מעט מדי, הזחלים יטפסו על קירות הבקבוקון בחיפוש אחר מזון. זחלים שאינם ניזונים מספיק גורמים למבוגרים קטנים שהם פחות פוריים.

שיטות הזנה חלופיות
מגוון שיטות נוסו להאכיל את הזחלים רק פעם אחת בשלב הזחל ולא 3 פעמים בשבוע. B. coprophila לא יגדל על מזון בסגנון Drosophila . ג’ון אורבן (תקשורת אישית) ניסה לערבב מזון B. coprophila עם אגר, אבל יותר מדי עובש גדל. הוא מצא כי הוספת שני מעכבי עובש (tegosept וחומצה פרופיונית) בשילוב ובבנפרד, תוך ניסיון מספר ריכוזים שונים, היו כולם רעילים ל-B. coprophila ברמות המעכבות עובש. האגר צריך להיות pH 6-7 (נייטרלי) כמו B. coprophila מקבל חולה ב pH חומצי (כמו עם חומצה propianic). לחלופין, כדי לייתר שלוש פעמים האכלה בשבוע, הוא ניסה להשתמש במרית או מזרק ללא מחט כדי לפזר משחת שמרים סמיכה (שמרים יבשים פעילים של הכוכב האדום מעורבבים עם מעט מים מזוקקים כדי להרטיב אותם) כבובה על גבי האגר בכל בקבוקון שבוע לאחר ההזדווגות (כלומר, בערך בזמן שהזחלים יתחילו לצאת).

שיטה נוספת להימנע מהאכלה שלוש פעמים בשבוע היא להוסיף תרבית חיה של פטריות לכל בקבוקון. Bath and Sponsler³⁷ דיווחו כי משטח אגר משופע עם המדיום של Sabouraud צריך להיות מפוספס עם תרבית פטרייתית של הסוג Chaetoconidia (הטוב ביותר) או אחרת Baplosporangia או Xllescheria. הפטרייה גודלה מספר ימים עד שבוע לפני הופעת B. coprophila . לא היה צורך בהאכלה לאחר מכן. גרסה של שיטה זו הופעלה גם על ידי אלן רש (תקשורת אישית). בידינו, הבקבוקונים היו רטובים מדי בשיטה זו והזחלים טבעו, אך ניתן היה לנסות שוב לייעל את מספר הזחלים ביחס לבקבוקונים עם פטריות חיות.

ארתור פורר (תקשורת אישית) זכה להצלחה מסוימת בגידול B. coprophila באותו אופן כמו עגור זבובים³⁸. בגישה זו גידלו את הגלמים על עיסת נייר לחה. לאחר מכן, הבוגרים הזדווגו והביצים הופקדו על עיסת נייר טרייה ולחה. הזחלים שנוצרו הוחזקו על עיסת נייר בצלחות פטרי והוזנו באבקת עלי סרפד פעמיים בשבוע. הגלמים הוכנסו לכלוב כדי לחזור על המחזור.

יוקיקו ימאשיטה (תקשורת אישית) ניסתה ללא הצלחה לגדל B. coprophila על הקרקע, מחקה את התנאים שבהם הם נמצאים בטבע בעציצים וחממות עם לחות גבוהה. עם זאת, עובש יכול להפוך לבעיה כאשר רמת הלחות עולה. עם זאת, אדמה לחה שימשה בהצלחה לגידול זחלי היגידה Pseudolycoriella (בעבר Bradysia) בקופסאות פלסטיק עם אדמה לחה; הם ניזונים מעלי Ilex paraguariensis מפורקים, בתוספת חיי הזחל המאוחרים עם 1.2% תמצית שמרים, 1.4% עמילן תירס, 0.8% קמח שיבולת שועל, 1.2% אגר¹². באופן דומה, ניתן להחליף את האדמה הלחה בטחב כבול לח בשעועית כליה כתושה כדי לגדל זבובי Sciarid^39,40.

שיטות אחרות ננקטו כדי לשמור על תרביות מעבדה של Bradysia: (i) תפוח אדמה אוטוקלאבי שאליו מוסיפים שמרים ודשן דם מיובש⁴¹; (2) זבל 42,43,44 שניתן להוסיף לו דם מיובש⁴⁵; (3) מכלי פלסטיק עם רפידות כותנה ומגבות נייר לחות עם פולי סויה טחונים⁴⁶.

קרדית
קרדית יכולה להיות מועברת מ Drosophila כדי B. coprophila. כדי למזער זאת, עדיף לשמור את B. coprophila בחממה נפרדת או בחדר, לא קרוב למניות Drosophila . יתר על כן, בצע כל עבודת תחזוקה של B. coprophila מוקדם ביום לפני הטיפול בדרוזופילה. קרדית יכולה גם להיות מועברת ל – B. coprophila מצמחי בית, לכן אין לשמור צמחים באותו חדר כמו B. coprophila. אם קרדית פולשת לבקבוקונים, ניתן לראות אותם כאורגניזמים כדוריים לבנים קטנים הזוחלים על גופו של B. coprophila. טיפולים כימיים הפועלים להשמדת קרדית בדרוזופילה אינם יכולים לשמש עבור B. coprophila מכיוון שהכימיקלים הורגים B. coprophila (B. coprophila רגיש גם לנדפים אורגניים כגון פנול). הטיפול היחיד להיפטר ממלאי קרדית B. coprophila הוא לאסוף ידנית את העוברים על צלחת אגר, לבדוק כל אחד מהם להיעדר קרדית, ולאחר מכן להעביר אותם לבקבוקוני אגר טריים באמצעות מברשת צבע עדינה. פקקי גזה מלאים כותנה ופלוגי קצף אצטט תאית (כפי שמשמשים בקבוקוני פוליפרופילן דרוזופילה ) שניהם מסייעים למנוע את כניסתן של קרדיות לבקבוקונים.

התועלת של פרוטוקולי הגידול
הפרוטוקולים המתוארים כאן יאפשרו לקהילה ההולכת וגדלה של מדענים לגדל את B. coprophila כאורגניזם מודל מתפתח חדש/ישן כדי לחקור את תכונותיו הביולוגיות הייחודיות. קבוצות מעבדה חדשות מוזמנות להצטרף לקהילה ההולכת וגדלה כדי לשמר ולחקור את המאפיינים הביולוגיים הייחודיים של Bradysia (Sciara).

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תודה מיוחדת לשומרי המניות הקודמים של B. coprophila (ג’ייקוב א. בליס, פאולה בונזינגה, אן ו. קרברוק, אינגריד מ. מרסר, היידי ס. סמית’) ולאנשי המחקר (במיוחד רוברט ביירד, מייקל ס. פולק, דונה קובאי, ג’ון מ. אורבן, יוטאקה ימאמוטו) על כוונון עדין של פרוטוקולי הגידול. הוראות ראשוניות לטיפול ב- B. coprophila ניתנו על ידי הלן ו. קרוס, נטליה גברוסביץ’-גרסיה, רבה מ. גודמן, צ’ארלס מץ ואלן ראש. בהכרת תודה ליוקיקו ימאשיטה ואן ו. קרברוק על שלקחו על עצמם את מרכז המניות Bradysia (Sciara). הערכה רבה לאנשים הבאים על הכנת האיורים המועילה שלהם: בריאן ויגמן (איור 1), ג’ון מ. אורבן (פאנל עליון באיור 4), לורה רוס (פאנל תחתון באיור 4), יוטאקה ימאמוטו (פאנל שמאלי באיור 5), ליאו קדוטה (איור 7 ואיור 8). תודה רבה לאווה פיליס ולמעבדה הרב-תחומית של אוניברסיטת בראון על עזרתם בצילום ובצילום. תודה לרוברט ביירד על הערות על כתב היד הזה. המחקר והתחזוקה שלנו של B. coprophila נתמכים על ידי NIH ו- NSF, כולל התמיכה האחרונה של NIH GM121455 ל- S.A.G. פרטים נוספים על B. coprophila זמינים באתרי Bradysia (Sciara) Stock Center (https://sites.brown.edu/sciara/ ו-https://sciara.wi.mit.edu) הנמצאים כעת בבנייה.

Materials

Agar (bacteriological)	U.S. Biological	A0930	https://www.usbio.net;
CO₂ FlyStuff Foot Pedal	Genesee Scientific	59-121
CO2 FlyStuff Blowgun	Genesee Scientific	54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypad	Genesee Scientific	59-172	https://www.geneseesci.com
Ether fume hood	Labconco	3955220	Sits on top of lab bench
			Filter replacement cat # 6961300
Food: Brewer’s Yeast Powder	Solgar		Obtain from Amazon or health food store
			https://www.solgar.com;
Food: Nettle Powder (pesticide free)	Starwest Botanicals	209460-51
Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)	Starwest Botanicals	202127-5	https://www.starwest-botanicals.com;
Food: Spinach Powder ( pesticide free)	Starwest Botanicals	209583-5
Food: Straw (pesticide free )	Starwest Botanicals	209465-3
Jar: clear glass, polypropylene lid	Fisher Scientific:	FB02911765	73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) https://www.fishersci.com;
Needle Probe, wooden handle	US Geo Supply Inc	SKU: 4190	5.75” long probe, stainless steel needle https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
Vials: glass, preferred:	Wilmad LabGlass
Wilmad-glass custom vials			28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com
Vials: glass (cheaper and ok)	Fisher Scientific	03-339-26H	29 mm outer dia, 9.5 cm h https://www.fishersci.com;
Vials: glass (a bit narrow)	Genesee Scientific	32-201	24.5 mm outer dia,9.5 cm h thttps://www.geneseesci.com
Vials: polypropylene	Genesee Scientific	32-114	28.5 mm outer dia,9.5 cm ht
Vial Plugs
roll of non-absorbent cotton	Fisher Scientific	22-456881
cheesecloth	Fisher Scientific	22-055053	https://www.fishersci.com;

Riferimenti

Lewin, H. A., et al. Earth BioGenome project: Sequencing life for the future of life. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (17), 4325-4333 (2018).
Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (14), 5690-5695 (2011).
Yeates, D. K., Wiegmann, B. M. Phylogeny of Diptera. Manual of Afrotropical Diptera.Suricata. 3, 149-161 (2017).
Vilkamaa, P., Burdíková, N., Ševčík, J. The genus Spinopygina gen. nov. (Diptera, Sciaridae) from Western North America: Preliminary molecular phylogeny and description of seven new species. Insects. 14 (2), 173 (2023).
Metz, C. W. Chromosome behavior, inheritance and sex determination in Sciara. Amer Naturalist. 72 (743), 485-520 (1938).
Gerbi, S. A., Hennig, N. Unusual chromosome movements in Sciarid flies. Results and Problems in Cell Differentiation. Vol 13 Germ Line – Soma Differentiation. 13, 71-104 (1986).
Gerbi, S. A., Larracuente, A., Hanlon, S. Non-random chromosome segregation and chromosome eliminations in the fly Bradysia (Sciara). 34;Non-Mendelian Inheritance and Meiotic Drive.", Chromosome Research.(special issue). 30, 273-288 (2022).
Steffan, W. A. A generic revision of the family Sciaridae (Diptera) of America North of Mexico. University of California Publications in Entomology. 44, 1-77 (1966).
Shin, S., Jung, S., Menzel, F., Heller, K., Lee, H. Molecular phylogeny of black fungus gnats (Diptera: Sciaroidea: Sciaridae) and the evolution of larval habitats. Molec Phylogenetics Evolution. 66 (3), 833-846 (2013).
Mohrig, W., Heller, K., Hippa, H., Vilkamaa, P., Menzel, F. Revision of the black fungus gnats (Diptera: Sciaridae) of North America. Studia Dipterologica. 19 (1-2), 141-286 (2013).
Ševčík, J., et al. Molecular phylogeny of the megadiverse insect infraorder Bibionomorpha sensu lato (Diptera). PeerJ. 4, e2563 (2016).
Menzel, F., et al. Pseudolycoriella hygida (Sauaia and Alves)-An overview of a model organism in genetics, with new aspects in morphology and systematics. Insects. 15 (2), 118 (2024).
Meigen, J. W. . Klassifikazion und Beschreibung der europäischen zweiflügligen Insekten (Diptera Linn). 1 (1), (1804).
Johannsen, O. A. The fungus gnats of North America part I. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 172, 209-276 (1909).
Johannsen, O. A. Mycetophilidae of North America. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 200, 57-146 (1912).
Urban, J. M., et al. Bradysia (Sciara) coprophila larvae up-regulate DNA repair pathways and down-regulate developmental regulators in response to ionizing radiation. Genetica. (3), (2024).
Hodson, C. N., Jaron, K. S., Gerbi, S., Ross, L. Gene-rich germline-restricted chromosomes in black-winged fungus gnats evolved through hybridization. PLoS Biology. 20 (2), e3001559 (2021).
Urban, J. M., et al. High contiguity de novo genome assembly and DNA modification analyses for the fungus fly, Sciara coprophila, using single-molecule sequencing. BMC Genomics. 22, 643 (2021).
Baird, R. B., et al. Recent evolution of a maternally acting sex-determining supergene in a fly with single-sex broods. Mol Biol Evol. 40 (7), (2023).
Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Making ends meet: targeted integration of DNA fragments by genome editing. Chromosoma. 127 (4), 405-420 (2018).
Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Development of transformation for genome editing of an emerging model organism. Genes. 13 (7), 1108-1124 (2022).
Metz, C. W., Smith, H. B. Further observation on the nature of the x-prime (X’) chromosome in Sciara. Proc Nat Acad Sci USA. 17 (4), 195-198 (1931).
Crouse, H. V. X-ray induced sex-linked recessive lethals and visibles in Sciara coprophila. Amer Naturalist. 95 (880), 21-26 (1961).
Metz, C. W., Ullian, S. S. Genetic identification of the sex chromosomes in Sciara (Diptera). Proc Nat Acad Sci USA. 15 (2), 82-85 (1929).
Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). I. Centromere localization. Chromosoma. 63, 39-55 (1977).
Crouse, H. V., Gerbi, S. A., Liang, C. M., Magnus, L., Mercer, I. M. Localization of ribosomal DNA within the proximal X heterochromatin of Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). Chromosoma. 64 (4), 305-318 (1977).
Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). II. The controlling element. Chromosoma. 74, 219-239 (1979).
Mok, E. H., et al. Maintenance of the DNA puff expanded state is independent of active replication and transcription. Chromosoma. 110 (3), 186-196 (2001).
Smith-Stocking, H. Genetic studies on selective segregation of chromosomes in Sciara coprophila Lintner. Genetica. 21 (4), 421-443 (1936).
Gabrusewycz-Garcia, N. Cytological and autoradiographic studies in Sciara coprophila salivary gland chromosomes. Chromosoma. 15, 312-344 (1964).
Wu, N., Liang, C., DiBartolomeis, S. M., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Developmental progression of DNA puffs in Sciara coprophila: amplification and transcription. Dev Biol. 160 (1), 73-84 (1993).
Yamamoto, Y., Gustafson, E. A., Foulk, M. S., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Anatomy and evolution of a DNA replication origin. Chromosoma. 130 (2-3), 199-214 (2021).
Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
Bertone, M. A., Courtney, G. W., Wiegmann, B. M. Phylogenetics and temporal diversification of the earliest true flies (Insecta: Diptera) based on multiple nuclear genes. Syst Entomol. 33, 668-687 (2008).
de Saint Phalle, B., Sullivan, W. Incomplete sister chromatid separation is the mechanism of programmed chromosome elimination during early Sciara coprophila embryogenesis. Development. 122 (12), 3775-3784 (1996).
de Saint Phalle, B., Oldenbourg, R., Kubai, D., Salmon, E. D., Gerbi, S. A. Paternal chromosome elimination and X non-disjunction on asymmetric spindles in Sciara male meiosis. BioRxiv. , (2021).
Bath, J. D., Sponsler, O. L. An alternative method for the culture of Sciara larvae. Science. 109 (2828), 255 (1949).
Forer, A. Crane fly spermatocytes and spermatids: A system for studying cytoskeletal components. Methods Cell Biol. 25, 227-252 (1982).
Gillespie, D. R. A simple rearing method for fungus gnats Corynoptera sp. (Diptera: Sciaridae) with notes on life history. J Entomol Soc Br Colum. 83, 45-48 (1986).
Gardiner, R. B., Jarvis, W. R., Shipp, J. L. Ingestion of Pythium spp. by larvae of the fungus gnat Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae). Ann Appl Biol. 116, 205-212 (1990).
Hungerford, H. B. Sciara maggots injurious to potted plants. J Econ Entomol. 9 (6), 538-549 (1916).
Thomas, C. A. A method for rearing mushroom insects and mites. Entomol News. 40, 222-225 (1929).
Austin, M. D., Pitcher, R. S. A laboratory method for rearing Sciara and phorid flies. Entomol Mon Mag. 72, 12-15 (1936).
Butt, F. H., Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. Culture of Sciara. Culture methods for invertebrate animals. , 400-401 (1937).
Hudson, E. K. Regulation of greenhouse sciarid fly populations using Tetradonema plicans (Nematoda: Mermithoidea). J Invert Pathol. 23 (1), 85-91 (1974).
Wilkinson, J. D., Daughterty, D. M. Comparative development of Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae) under constant and variable temperatures. Ann Entomol Soc Am. 63 (4), 1079-1083 (1970).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Gerbi, S. A. Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism. J. Vis. Exp. (206), e66751, doi:10.3791/66751 (2024).