Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly <i>Bradysia (Sciara) coprophila</i>: A New/Old Emerging Model Organism

Susan  A. Gerbi

doi:10.3791/66751

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biologia

الصيانة المختبرية لذبابة الدبتيران السفلى براديسيا (Sciara) coprophila: كائن نموذجي جديد / قديم ناشئ

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66751

Susan A. Gerbi

¹Department of Molecular and Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Summary

توضح هذه الورقة الصيانة المختبرية (بما في ذلك التزاوج والتغذية) لذبابة الدبتيران السفلى Bradysia (Sciara) coprophila.

Abstract

تم الحفاظ على المخزونات المختبرية لذبابة dipteran السفلى ، Bradysia (Sciara) coprophila ، لأكثر من قرن. يتم عرض بروتوكولات الصيانة المختبرية ل B. coprophila هنا. وستكون هذه البروتوكولات مفيدة للعدد المتزايد بسرعة من المختبرات التي تدرس B. coprophila للاستفادة من سماتها البيولوجية الفريدة، والتي تشمل (1) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول؛ و (2) مغزل أحادي القطب في (2) عدم انفصال ثنائي X في الانقسام الاختزالي الذكري II ؛ (3) بصمة الكروموسوم لتمييز الأم عن المتماثلات الأبوية ؛ (4) كروموسومات محدودة الخط الجرثومي (L) ؛ (5) إزالة الكروموسومات (كروموسومات الأب في الانقسام الاختزالي الذكري الأول ؛ واحد إلى اثنين من الكروموسومات X في الأجنة المبكرة ؛ كروموسومات L من سوما في الأجنة المبكرة) ؛ (6) تحديد الجنس من قبل الأم (لا يوجد كروموسوم Y) ؛ و (7) تضخيم الحمض النووي المنظم تنمويا في مواقع نفخة الحمض النووي في كروموسومات بوليتين الغدد اللعابية اليرقية.

أصبح من الممكن الآن استكشاف هذه الميزات الفريدة العديدة لميكانيكا الكروموسومات باستخدام التطورات الحديثة في تسلسل وتجميع جينوم B. coprophila وتطوير منهجية التحول للهندسة الجينومية. سيستفيد المجتمع العلمي المتنامي الذي يستخدم B. coprophila للبحث من البروتوكولات الموصوفة هنا لتزاوج الذباب (علامات النمط الظاهري للأمهات اللواتي سيكون لديهن أبناء فقط أو بنات فقط ؛ تفاصيل التزاوج الجماعي للتجارب الكيميائية الحيوية) ، وفحص فقس الجنين ، وتغذية اليرقات ، وغيرها من التعليقات على تربيتها.

Introduction

يتطلب الفهم الكامل للمبادئ البيولوجية دراسة العديد من الكائنات الحية المتنوعة التي تمتد عبر شجرة الحياة. على الرغم من وصف مجموعة واسعة من الكائنات الحية خلال^{نهاية القرن} 19 ، بحلول^{منتصف القرن} 20 أصبحت الدراسات التجريبية تقتصر على حفنة من أقل من اثني عشر الكائنات النموذجية. مع ظهور عصر الجينوم والهدف المتمثل في تسلسل الجينوم من جميع الأنواع في شجرة الحياة¹ ، أصبحنا الآن في وضع يسمح لنا بتوسيع أنواع الكائنات الحية المستخدمة في التجارب المعملية وجني ميزة تنوعها. هذا التوسع في الكائنات النموذجية الناشئة للتجارب له شرط أساسي للقدرة على الحفاظ عليها في المختبر. هنا ، يتم وصف البروتوكولات لتربية أحد هذه الكائنات النموذجية الجديدة / القديمة الناشئة.

يتم حساب غالبية الحياة الحيوانية على الأرض من خلال أربعة إشعاعات فائقة من الحشرات². يوجد داخل الحشرات حوالي 158000 نوع من Diptera (الذباب الحقيقي)³ ، مع حوالي 3000 نوع في عائلة Sciaridae (البعوض الفطري الأسود)⁴. ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة هي الأكثر دراسة بدقة من ذباب Dipteran. تباعدت ذبابة ديبتيران السفلى (Nematocera) ، Bradysia (التي كانت تسمى سابقا Sciara) coprophila ، قبل 200 مليون سنة عن ذبابة الفاكهة ، وهي ذبابة “Dipteran العليا” (Brachycera). لذلك ، فإن B. coprophila في وضع تصنيفي موات للدراسات المقارنة مع D. melanogaster (الشكل 1). علاوة على ذلك ، تتمتع B. coprophila بالعديد من الميزات البيولوجية الفريدة التي تستحق الدراسة في حد ذاتها⁵^،⁶^،⁷. العديد من هذه الصفات تعصي قاعدة ثبات الحمض النووي (DNA) التي تحتوي فيها جميع خلايا الكائن الحي على نفس محتوى الحمض النووي. في B. coprophila ، (i) يتم التخلص من جينوم الأب على مغزل أحادي القطب في الانقسام الاختزالي الذكري I. (ii) هناك عدم انفصال للثنائي X في الانقسام الاختزالي الذكري II ؛ (iii) يتم التخلص من الكروموسومات ذات الخط الجرثومي المحدود (L) من سوما ؛ و (iv) يتم التخلص من واحد أو اثنين من كروموسومات X في الجنين المبكر اعتمادا على جنس الفرد. تم اكتشاف بصمة الكروموسوم لتمييز المتماثلات الأم عن الأب لأول مرة في B. coprophila وهي تلعب دورا في العديد من أحداث التخلص من الكروموسومات هذه. بالإضافة إلى التخلص من الكروموسومات ، يحدث تجاوز آخر لثبات الحمض النووي عن طريق تضخيم الحمض النووي الخاص بالموقع المنظم تنمويا في مواقع نفخة الحمض النووي في كروموسومات بوليتين الغدد اللعابية اليرقية. تتطلب دراسات هذه الميزات الفريدة صيانة مختبرية ل B.coprophila. يتم عرض تفاصيل تربيتها هنا لتسهيل مثل هذه الدراسات.

الشكل 1: نشوء براديسيا (Sciara) كوبروفيلا. يشار إلى الكائنات النموذجية الشائعة بالخط الأزرق وترتيبها التصنيفي بخط أحمر. Bradysia وغيرها من البعوض الفطري Sciarid وكذلك البعوض هي ذباب dipteran السفلي (سابقا ، تحت رتبة Nematocera) ، في حين أن أنواع ذبابة الفاكهة هي ذباب dipteran أعلى (فرعي: Brachysera). المعلومات الموجودة على الجانب الأيسر من الشكل مأخوذة من Misof et ^al.33; المعلومات الموجودة على الجانب الأيمن مأخوذة من Bertone et ^al.34 و Wiegmann et ^al.2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في السابق ، كان لدى جنس Sciara أكبر عدد (700) من الأنواع لأي حقيقي النواة ، مما دفع ستيفان إلى تقسيمها⁸. في وقت لاحق ، اقترح شين تقسيم عائلة Sciaridae إلى فصيلة فرعية Sciarinae (مع ستة أجناس بما في ذلك Scyara و Trichosia و Leptosciarella) ، و Megalosphyinae الفرعية (بما في ذلك جنس Bradysia) وثلاث مجموعات أخرى (بما في ذلك Pseudolycoriella) ⁹. تمت دراسة سلالة Sciaridae بشكل أكبر من قبل عدة مجموعات في السنوات الأخيرة⁹^،¹⁰^،¹¹. على مدى العقود العديدة الماضية ، تغيرت أسماء العديد من الكائنات الحية في عائلة Sciaridae¹². على الرغم من أن معظم الأدبيات التي تمتد لأكثر من قرن تشير إلى الكائن الحي الذي ندرسه باسم Sciara coprophila ، إلا أن اسمه التصنيفي الحالي هو الآن Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola ومرادفات أخرى)¹⁰. تم العثور عليها في جميع أنحاء العالم وتعرف باسم البعوض الفطري لأنها تأكل الفطر والفطريات الأخرى. تم وصفها لأول مرة في عام 1804 من قبل Meigen¹³ في أوروبا وبعد ذلك من قبل Johannsen ^14,15 في أمريكا الشمالية. تم جمع B. coprophila في مختبر كولد سبرينج هاربور وتم إنشاء مخزون المختبرات من قبل تشارلز ميتز في أوائل أواخر القرن التاسع عشر عندما كان طالب دراسات عليا في جامعة كولومبيا مع توماس هانت مورغان. وبالتالي ، فإن المخزونات الحالية تعكس قرنا من زواج الأقارب. وبالمثل ، تم توضيح بيولوجيا B. coprophila بشكل أكبر من خلال عقود من الدراسات الوراثية الخلوية التي أجرتها هيلين كروس (التي حصلت على درجة الدكتوراه مع باربرا مكلينتوك).

في ثلاثينيات القرن العشرين ، تنافس Bradysia (Sciara) مع ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر كنظام نموذجي للدراسات الوراثية. على الرغم من العديد من السمات البيولوجية الفريدة ، فقد طغى D. melanogaster على B. coprophila ككائن نموذجي شائع نظرا لأن طفرات النمط الظاهري التي يسببها الإشعاع كانت ضرورية للدراسات الجينية وكان من الأسهل تحقيقها في الأخير ، على الرغم من أن B. coprophila أكثر مقاومة قليلا لإشعاع جاما من D. melanogaster¹⁶. في العصر الحديث لعلم الجينوم ، لم يعد هذا مصدر قلق. نظرا لأن تسلسل الجينوم¹⁷^،¹⁸^،¹⁹ (Urban و Gerbi و Spradling ، البيانات غير معروضة) وطرق التحويل^20,21 (Yamamoto و Gerbi ، البيانات غير معروضة) ل B. coprophila أصبحت متاحة مؤخرا ، فقد حان الوقت الآن لاستخدامها كنظام نموذجي جديد / قديم ناشئ ، كما يراه المجتمع المتنامي من العلماء الذين اعتمدوه لأبحاثهم. توضح هذه المقالة إجراءات صيانة المختبر.

تفتقر B. coprophila إلى كروموسوم Y ، ويتم تحديد جنس النسل من قبل الأم. الإناث التي لديها كروموسوم X (“X-prime”) مع انعكاس طويل شبه مركزي سيكون لها بنات فقط ، في حين أن الإناث المتماثلة الزيجوت للكروموسوم X القياسي (غير المقلوب) سيكون لها أبناء فقط⁵ (الشكل 2). تتوفر معلومات التسلسل للكروموسوم^{X 19} ، لكن الآلية الجزيئية لا تزال بحاجة إلى توضيح حول كيفية تحديد كروموسوم X للنسل سيكون إناثا. الذكور لا تملك أبدا كروموسوم X ، وبعد الإخصاب ، تكون الإناث X’X (متغاير الزيجوت ل X’) أو XX. يمكن تمييز الإناث X’X البالغات عن الإناث XX من خلال علامات النمط الظاهري على الجناح (الشكل 3). يمكن التعرف على إناث X’X (اللواتي سيكون لديهن بنات فقط) من خلال علامة الجناح المتموجة (W) المهيمنة على X ‘(كما هو الحال في سهم HoLo2)²². بدلا من ذلك ، يمكن التعرف على الإناث XX (اللواتي سيكون لديهن أبناء فقط) من خلال علامة الجناح الصغيرة المتنحية (p) على X كما هو الحال في مخزون 91S²³. في هذه الحالة ، سيكون للإناث X’Xp أجنحة كاملة الطول (وليست صغيرة) وسيكون لها بنات فقط. يحمل المخزون 6980 علامة متنحية على كروموسوم X للأوردة المتورمة (sw)²⁴ ، بالإضافة إلى العلامة المهيمنة المتموجة على X ‘، مما يسمح بعلامتين للاختيار للصلبان. يمكن أن تختلف درجة التعبير عن المتموج وتبدو أضعف في القوارير المكتظة حيث يكون الطعام محدودا أو إذا أصبحت درجة الحرارة دافئة جدا. يكون النمط الظاهري للجناح المتموج قويا بشكل استثنائي إذا تم الاحتفاظ باليرقات في الغرفة الباردة (4 درجات -8 درجة مئوية) بدلا من 21 درجة مئوية المعتادة. على الرغم من أن علامة الجناح الصغيرة المتنحية ليست متغيرة ويسهل التعرف عليها ، إلا أن أسهم 91S تستخدم بشكل أقل تكرارا لأنها أقل صحة من مخزون HoLo2. يتم عرض مخططات التزاوج B. coprophila هنا (الشكل 2) ، ويتم وصفها بالتفصيل لأسهم HoLo2 و 7298 و W14 (الملف التكميلي 1) ، ومخزون 91S (الملف التكميلي 1) ، ومخزون 6980 (الملف التكميلي 1) ، ومخزون النقل (الملف التكميلي 1). لم تعد مخزونات النقل موجودة. كانت عمليات نقل متبادلة للكروموميرات غير المتجانسة (H1 و H2 و H3) على الذراع القصير ل X الذي يحتوي على جينات الحمض النووي الريبوزي^{الريبوسومي 25}^،²⁶^،²⁷.

الشكل 2: مخطط التزاوج ل B. coprophila. هذا الكائن الحي لا يحتوي على كروموسوم Y (سوما الذكور لديه X واحد) ؛ تحدد الأمهات جنس ذريتهن. الأمهات XX لديهن أبناء فقط والإناث X’X لديهن بنات فقط. يحتوي كروموسوم X على انعكاس طويل شبه مركزي عند مقارنته بالكروموسوم X. يشار إلى سلالة الأب أو الأم للكروموسوم X (أو X’) باللون الأزرق أو الأحمر ، على التوالي ، في هذا الشكل. المنوية أحادية الصيغة الصبغية للكروموسومات الجسمية، لكنها تحتوي على نسختين من الكروموسوم X بسبب عدم الانفصال في الانقسام الميوزي الثاني. النسب الجسدي للأجنة المبكرة يلغي نسخة أو نسختين من X المشتقة من الأب إذا كانت أنثى أو ذكرا ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الأنماط الظاهرية لجناح B. coprophila. تظهر إناث الذباب البالغة بأنماط ظاهرية مختلفة للجناح: (أ) الجناح المستقيم (XX) ، (ب) الجناح المتموج (_X’WX) ، (ج) النمط الظاهري المتموج الشديد للجناح (_X’WX) الذي له مظهر ذابل بعد تخزين اليرقات في الروالبارد م ، (د) الجناح الصغير (XpXp) الذي يشبه الآثار ، (ه) الجناح المستقيم مع النوع البري (XX) وليس الأوردة المنتفخة ، (F) جناح مستقيم مع أوردة منتفخة (XswXsw) حيث تظهر فقاعات صغيرة (أسهم سوداء) على الحافة العلوية للجناح و / أو بالقرب من طرف كلا الجناحين ، (G) مثال متطرف على التورم حيث تحدث نفطة (سهم أبيض) على أحد الجناحين أو كليهما. يفتقر الذكور إلى كروموسوم X ، وبالتالي لن يكون لديهم أجنحة متموجة أبدا ، ولكن لديهم أجنحة صغيرة أو منتفخة في مخزون 91S أو مخزون 6980 ، على التوالي. شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الهدف من صيانة المخزون هو إجراء الصلبان حيث يكون نصف الصلبان من الأمهات المنتجات الإناث ونصف الصلبان من الأمهات المنتجات للذكور للحصول على أعداد متساوية من الإناث والذكور البالغين في الجيل التالي للتهجين اللاحقة. ومع ذلك ، فإن هذا ينطوي أيضا على التخطيط لأن دورة حياة الذكور أقصر من الإناث ويظهر الذكور البالغين قبل أسبوع من الإناث البالغات. تستوعب الطبيعة هذا التزامن بين الجنسين من خلال ظهور الأجنة الذكور على شكل يرقات بعد 1-2 أيام من اليرقات الأنثوية من التهجين في نفس التاريخ. ومع ذلك ، لضمان توفر الذكور والإناث البالغين في نفس الوقت للتهجين المختبري ، يمكن تسريع نمو الإناث إلى حد ما عن طريق ترك قوارير مع يرقات الإناث في درجة حرارة الغرفة بدلا من 21 درجة مئوية أو وضع قوارير مع يرقات الذكور في درجات حرارة أقل قليلا (على سبيل المثال ، 16 درجة مئوية). طريق آخر أكثر ضمانا هو القيام بالصلبان مع الأمهات المنتجات يوم الاثنين والعبور مع الأمهات المنتجات الذكور يوم الجمعة من نفس الأسبوع. أسهل طريق، وهو ما نستخدمه، هو أداء الصلبان مع الأمهات المنتجات والأمهات المنتجات في نفس اليوم من كل أسبوع وأداء الصلبان في ذلك اليوم في كل أسبوع متتالي. في هذا النهج ، يمكن تزاوج الإناث البالغات من صليب في الأسبوع 1 مع الذكور البالغين الذين خرجوا من صليب في الأسبوع 2.

دورة حياة أنثى B. coprophila هي 5 أسابيع عند تربيتها عند 21 درجة مئوية (الجدول 1). طول دورة حياتها أطول إلى حد ما في درجات حرارة أكثر برودة أو إذا كانت تعاني من نقص التغذية. دورة حياة الذكور B. coprophila هي ~ 4-4.5 أسابيع منذ أن جرنقوا 0.5-1 أسبوع قبل الإناث. تتميز نهاية كل يرقات بتساقط البشرة ، والذي ينجم عن انفجار في مستوى هرمون الستيرويد ecdysone. على عكس D. melanogaster ، الذي يحتوي على ثلاثة نجوم يرقية ، فإن B. coprophila لديها أربعة نجوم يرقية.

المرحلة التنموية	أيام ما بعد التزاوج (dpm)	طول المرحلة (أيام)
وضعت البيض	1-2
الجنين	1-2 إلى 7-8	~7 أيام
اليرقه
اليرقات 1 و 2 و 3	7-8 إلى 16-19	~ 10
4 اليرقات Instar قبل بقعة العين	16-19 إلى 21-24	5
4 مرحلة بقعة العين اليرقية	21-24 إلى 25-28	4
بوبا	25-28 إلى 30-33	5
بالغ	يعيش 1-2 أيام عند 21 درجة مئوية إذا تزاوج أو يعيش 2-3 أسابيع عند 16 درجة مئوية إذا لم يتزاوج.

الجدول 1: دورة حياة أنثى B. coprophila عند 21 درجة مئوية.

يمكن الاحتفاظ ب B. coprophila في أي مكان في حدود 15 درجة مئوية -25 درجة مئوية ، مع تقدم التطور بشكل أبطأ في درجات الحرارة المنخفضة. تفضل هذه الحشرة بيئة رطبة (توجد في تربة النباتات المنزلية أو أسرة الفطر) ، لذلك نحتفظ بكأس به ماء منزوع الأيونات في الحاضنة. يمكن حفظ B. coprophila في درجة حرارة الغرفة في صندوق خبز معدني بغطاء غير مناسب ويحتوي على دورق من الماء ، لكنها تتعرض لصدمة حرارية عند 37 درجة مئوية²⁸ ، وهو خطر في المناخات الحارة. حاول مايكل آشبرنر وآخرون دون نجاح يذكر تخزين D. melanogaster في البرد لتقليل الوقت اللازم لحفظ المخزون. في المقابل ، تتمثل الميزة الرئيسية ل B. coprophila في أنه يمكن تخزين القوارير التي تحتوي على يرقات منتصف المرحلة لمدة تصل إلى 3 أشهر على رف مفتوح في الغرفة الباردة (4-8 درجة مئوية) مع الحد الأدنى من العناية بالتغذية مرة واحدة فقط في الشهر. تتطور ببطء شديد في البرد حتى مرحلة العذراء وستظهر كبالغين خصبين عندما يتم إعادة القوارير إلى 21 درجة مئوية. من المفترض أن هذا يحاكي الشتاء في البرية. قد يكون هذا التوقف التنموي الناجم عن البرد مشابها لتلك التي شوهدت بعد تشعيع جاما ليرقات B. coprophila ¹⁶ في منتصف المرحلة ، ولكن لا يظهر التوقف التنموي في اليرقات في المرحلة المتأخرة التي تجاوزت نقطة اللاعودة لتقدمها التنموي الطبيعي.

Protocol

تمثل البروتوكولات الموصوفة هنا قرنا من الخبرة من مراكز الأسهم Bradysia (Sciara) التي يشرف عليها بالتتابع تشارلز ميتز وهيلين كروس وسوزان جيربي بالإضافة إلى مدخلات من آخرين. 1. الصلبان التزاوج استخدم أنثى بالغة واحدة واثنين من الذكور البالغين لكل قارورة زجاجية قطرها 28 مم. بمجرد تحقيق نجاح بنسبة 100٪ في التعرف على الأنماط الظاهرية للجناح للأمهات اللواتي سيكون لديهن بنات أو أبناء فقط ، استخدم إناث وذكرين لكل قارورة لزيادة عدد اليرقات / القارورة. أضف الإناث إلى كل قارورة قبل إضافة الذكور الذين يستيقظون من التخدير بشكل أسرع من الإناث.ملاحظة: يفترض الوصف أدناه أن لديك CO2 ؛ بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأثير لتخدير الذباب البالغ. في حالة استخدام الأثير لتخدير الذباب البالغ ، قم بلصق وسادة من مناديل المختبر المطوية (على سبيل المثال ، kimwipes) داخل غطاء زجاجي دائري لجرة كوبلين واستخدم قطارة لنقل بعض الأثير من الزجاجة لترطيب وسادة مسح المختبر (ولكن ليست مشبعة ورطبة جدا بحيث يسقط سائل الأثير منها ويخاطر بإغراق الذباب). بالنسبة للخطوة 1.6 أدناه ، ضع وسادة الأثير المبللة أعلى القارورة المفتوحة لمدة ~ 1 دقيقة حتى يتوقف البالغون عن الحركة. بمجرد نقل البالغين إلى صفيحة بلاط خزفية بيضاء (تستخدم بدلا من وسادة الذباب البيضاء) ، بشكل دوري (عندما تبدأ أرجل الذباب في الارتعاش) ، أمسك الوسادة التي تم ترطيبها حديثا (لا تلمس) الذباب على اللوحة لمدة ~ 1 دقيقة.تنبيه: الأثير قابل للاشتعال ويجب تخزينه في غطاء تهوية وليس في الثلاجة. رتب في متناول اليد صينية بها قوارير من الإناث البالغات ، وصينية بها ذكور بالغات ، وصينية من القوارير الفارغة تحتوي على 2.2٪ (وزن / مجلد) أجار. على مقعد المختبر ، ضع ملاحظات لافتة تنص على “أنثى” أو “ذكر” والنمط الظاهري للجناح للأم بحيث يتم وضع القارورة مع البالغين المختارين للصليب في المجموعة الصحيحة ، حيث سيكون لجميع القوارير في مجموعة واحدة ذرية ذكور فقط وجميع القوارير في المجموعة الأخرى سيكون لها ذرية أنثى فقط.ملاحظة: تأكد من عدم وجود قطرات تكثيف داخل القارورة لأن البالغين سوف يلتصقون بالقطرات. إذا تم تخزين القوارير في صندوق بلاستيكي ، ضع القوارير على مقعد المختبر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام للسماح للتكثيف بالتبخر. قم بتشغيل غاز CO2 والمصباح لمجهر التشريح.ملاحظة: يفضل استخدام مصدر ضوء يحتوي على ألياف بصرية لأنه ينبعث منه حرارة أقل ، مما يؤدي إلى استيقاظ الذباب المخدر بشكل أسرع. اضغط بقوة على القارورة مع البالغين على وسادة مطاطية بحيث يسقط البالغون في قاع القارورة ويزيلون القابس ؛ أدخل فوهة مسدس CO2 وأضف القابس مرة أخرى. اضغط على مشغل الفوهة بحيث يتدفق CO2 إلى القارورة لمدة ~ 1 دقيقة لتخدير البالغين. ضع قدما على دواسة القدم بحيث يتدفق CO2 على وسادة الطيران البيضاء بدلا من فوهة البندقية. حافظ على ضغط دواسة القدم طوال الوقت الذي يكون فيه الذباب على منصة الذباب البيضاء (أو قم بالضغط بشكل متقطع على دواسة القدم كلما بدأت أرجل الذباب في الارتعاش). قم بإزالة الفوهة وسدادها من القارورة واقلب القارورة فوق وسادة ذبابة بيضاء تحت مجهر تشريح. اضغط على الجزء السفلي من القارورة المقلوبة ضد المجهر بحيث يسقط الكبار من القارورة على وسادة الذبابة البيضاء. حدد البالغين الأكثر بدانة (تم إغلاقه مؤخرا ببطون بيضاء) واستخدم ملقط ذو رؤوس دقيقة لالتقاط الشخص البالغ برفق من ساقه الوسطى أو الخلفية. لا تجرح الأرجل الأمامية المستخدمة في رقصة التزاوج. لا تستخدم البالغين الذين لديهم للتو مغلقون وأجسامهم بيضاء بالكامل ولم تتحول بعد إلى اللون الأسود لأن أجنحتهم ستكون قصيرة وغير مكتملة النمو بحيث لا يمكن تسجيل النمط الظاهري للجناح. لا يزال من الممكن استخدام البالغين ذوي البطن النحيلة ، على الرغم من انخفاض الخصوبة. لا تستخدم البالغين النحيفين الذين ترفع أجنحتهم عموديا بعيدا عن أجسادهم ، لأنهم ماتوا. من ناحية أخرى ، قم بإزالة القابس من القارورة بأجار 2.2٪ (بالوزن / المجلد). باستخدام اليد التي تمسك الملقط مع الشخص البالغ ، اضغط على الملقط بقوة على الجزء العلوي الداخلي من القارورة بحيث يسقط البالغ في أسفل القارورة. استبدل القابس في القارورة. كرر الخطوات من 1.5 إلى 1.11 أعلاه لإعداد كل قارورة تحتوي على إناث بالغات. استخدم فرشاة الرسم لمسح الذباب غير المستخدم من وسادة الذباب البيضاء إلى القارورة الأم. ضع علامة اختيار على ملصق القارورة الأم للإشارة إلى أنه تم استخدامها للتزاوج (على الرغم من أنه يمكن استخدامها مرة أخرى إذا لزم الأمر). وللصيانة الروتينية للمخزون، قم بإعداد 6-8 قوارير مع أمهات منتجات و6-8 قوارير للأمهات المنتجات الذكور (الشكل 4). قم بإعداد نصف القوارير مع الأمهات (أو الآباء) من قارورة واحدة للبالغين والنصف الآخر من القوارير الجديدة باستخدام قارورة للبالغين مختلفة لتقليل الاختناقات الجينية.في بعض الأحيان ، ينتج حدث سوء الفصل ذكرا استثنائيا في قوارير منتجة للإناث. إذا كانت القارورة التي تحتوي على إناث بالغة بها ذكر استثنائي ، فقم بإزالتها وسحقها لقتل هذا الذكر. إذا أمكن ، تخلص من جميع الإناث من تلك القارورة وانتظر بضعة أيام حتى تغلق المزيد من الإناث البالغات ويمكن استخدامها بأمان للصلبان.ملاحظة: يفضل عدم استخدام الإناث في تلك القارورة للتهجين لأنها قد تتزاوج مع الذكر الاستثنائي ولا تنتج صليبا خصبا. بمجرد إضافة الإناث البالغات إلى جميع القوارير ، كرر الخطوات 1.5-1.11 لإضافة ذكرين بالغين (الشكل 4) إلى كل قارورة تحتوي بالفعل على إناث الذباب. اضغط على القارورة مع الإناث على وسادة مطاطية حتى لا يهربوا عند إضافة الذكور بالتتابع.ملاحظة: اعمل بسرعة ولا تفرط في تخدير الذباب البالغ لأن ذلك سيقتلهم. أضف ملصقا إلى كل قارورة يوضح المخزون ، والصليب (للذرية الأنثوية أو الذكرية) ، وما إذا كانت الأم قد جاءت من قارورة بالغة # 1 أو # 2 ، وتاريخ التزاوج. أدخل أيضا المعلومات أعلاه في دفتر ملاحظات وحدد عدد القوارير التي تم إعدادها لكل صليب.ملاحظة: من الملائم إضافة منشفة ورقية لفصل القوارير المنتجة للذكور عن القوارير المنتجة للإناث في الدرج. اترك القوارير دون إزعاج على سطح العمل لمدة ~ 15 دقيقة للتأكد من أن البالغين يستيقظون ويطيرون حولها. لاحظ ما إذا كانوا يتزاوجون (بعد وقت قصير جدا من استيقاظهم) حيث يتم توجيه الأنثى والذكور من الخلف إلى الخلف (سوف يمسك المشبك الذكر بالمبيض المدبب للأنثى) (الشكل 4 ، أسفل).ملاحظة: ستقبل الأنثى البالغة ذكرا بالغا مرة واحدة فقط ، لذلك لا تزاحم القوارير بعد التزاوج لأن هذا قد يفصل الذكر عن الأنثى أثناء عملية التزاوج ولن تتزاوج تلك الأنثى مرة أخرى. ضع الصينية مع قوارير متزاوجة في الحاضنة (على سبيل المثال ، 21 درجة مئوية). قم بتسمية الدرج باسم المخزون (على سبيل المثال ، HoLo2) وأسبوع دورة الخمسة أسابيع (الأسابيع 1 أو 2 أو 3 أو 4 أو 5).ملاحظة: احتفظ بالدرج مع الذباب المتزاوج للتو في جزء منفصل من الحاضنة أو حاضنة أخرى كتذكير بعدم إطعام القوارير حتى تظهر اليرقات (الموضحة أدناه). 2. التزاوج الجماعي ملاحظة: عادة ، سيكون لدى أم B. coprophila واحدة 60 نسلا في حضنتها. عندما يكون هناك حاجة إلى عدد أكبر من النسل لإجراء التجارب ، يمكن إجراء تزاوج جماعي بدلا من التزاوج أحادي الزوج الموصوف أعلاه. يمكن إجراء التزاوج الجماعي في قوارير زجاجية قياسية قطرها 28 سم عندما يتم جمع الأمهات بعد يوم واحد لوضع البيض المستحث وجمع الأجنة. ومع ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى عدد أكبر من اليرقات ، يتم التزاوج الجماعي في جرة ذات سطح أكبر لمنع الاكتظاظ. بيرس عدة ثقوب صغيرة في غطاء الجرة بحيث يمكن لليرقات الحصول على بعض الهواء للتنفس. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه في القسم 1 ولكن استخدم ملقط ذو رؤوس دقيقة لنقل جميع الأمهات المنتجات (أو جميع الأمهات المنتجات الذكور) إلى الزاوية الأمامية من منصة الطيران البيضاء. استخدم 10-15 من الإناث البالغات المخدرات واكتسح هذه المجموعة بفرشاة رسم في القارورة أو الجرة ذات الثقوب الصغيرة المثقوبة في الغطاء.ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوتين 2.1 و 2.2. بسرعة للتزاوج الجماعي لتجنب الإفراط في التخدير الذي من شأنه أن يمنع الصلبان الخصبة. حدد 20-25 من الذكور البالغين المخدرين ونقلهم بالملقط ذي الرؤوس الدقيقة إلى الزاوية الأمامية من وسادة الذبابة البيضاء. اضغط بقوة على القارورة أو الجرة مع الإناث على وسادة مطاطية حتى لا يهربوا عند إزالة القابس أو الغطاء لاكتساح المجموعة المخدرة من الذكور البالغين من وسادة الذبابة البيضاء باستخدام فرشاة الرسم. 3. جمع الأجنة بعد التزاوج الجماعي يوم واحد (24 ساعة) بعد التزاوج ، قم بإجراء الخطوات 1.5-1.11 لتخدير الذباب البالغ (خليط من الإناث والذكور) ونقله إلى وسادة ذبابة بيضاء.ملاحظة: لم يكتمل تكوين البويضة بعد عندما يتزاوج الذباب البالغ ، مما يؤدي إلى اختزالية الانتهاء. يتم تخصيب البويضات الناضجة بواسطة المنوية المخزنة في المنوية عند تفريغ البويضات 29. يمكن أن يستغرق الانتهاء من تكوين البويضة 1-2 أيام ، وهذا هو السبب في السماح بيوم واحد بعد التزاوج قبل وضع البيض. باستخدام ملقط رفيع الرأس ، التقط أنثى بالغة من جناحيها وضعها على طبق بتري قطره 100 مم يحتوي على 2.2٪ (وزن / مجلد) أجار ، مع إدخال أجنحتها في الأجار. كرر هذه الخطوة بالتتابع لكل أنثى بالغة على منصة الطيران البيضاء. تخلص من الذكور البالغين على منصة الطيران. بمجرد أن يتم اختناق جميع إناث الذباب على الأجار ، قم بتحفيز وضع البيض عن طريق الضغط برفق على الرأس بالملقط حتى تحصل أنثى الذبابة على حركات تشبه النوبات. بدلا من ذلك ، اضغط برفق على صدرها. ستضع بعد ذلك مجموعة من البيض المخصب في غضون 30-60 دقيقة. قم بتغطية طبق بتري بغطاءه المبلل بمسح مختبر مبلل بالماء لمنع الانجذاب الكهروستاتيكي للبيض إلى الغطاء. 4. فحص “فقس” اليرقات تحقق من وجود “فقس” اليرقات بعد 1 أسبوع من التزاوج ؛ قم بإزالة القابس من القارورة واستخدم مجهر تشريح لتسجيل اليرقات. سيفتح فكهم الأسود ويغلق بشكل متكرر وسيتحركون ببطء للأمام. إذا كان هناك عدد قليل من اليرقات ، فاكتب “قليل” على ملصق القارورة ، كتذكير لإطعام تلك القارورة بشكل أقل. افحص كل قارورة في الدرج مع هذا الصليب وأدخل عدد القوارير مع اليرقات في دفتر الملاحظات في عمود بجوار عدد القوارير التي تم إعدادها في هذا التزاوج.ملاحظة: لن يتطور البيض الأصفر العميق. من المرجح أن يتطور البيض الأبيض وقبل 1 يوم من ظهور اليرقات ، سوف تتطور الصباغ الأسود (الفك المستقبلي) في الطرف الأمامي من البويضة. لا تخطئ في العفن بخيوط بيضاء تنتهي في كرة سوداء في نهايتها لليرقات – لن يتحرك القالب ، على عكس اليرقات التي تزحف للأمام على الآجار. أضف القليل من القش (مرة واحدة فقط) إلى كل قارورة مع اليرقات للتحكم في الرطوبة الزائدة وتوفير مكان للاختباء لليرقات. انقل الصينية إلى الحاضنة (على سبيل المثال ، 21 درجة مئوية) مع صواني اليرقات من تهجينات التزاوج في الأسابيع السابقة وابدأ في تغذية القوارير باليرقات الناشئة حديثا (انظر القسم أدناه حول التغذية).ملاحظة: بشكل عام ، ستكون اليرقات في مجموعة بالقرب من والدتها الميتة وستبدأ في أكلها. من المفترض أن هذا ينقل الخميرة من أمعاء الأم إلى أمعاء اليرقات. يمكنك البدء في التغذية في اليوم الذي تظهر فيه اليرقات أو في غضون 2 أيام بعد ذلك. تنبيه: إذا تأخرت التغذية ، فإن اليرقات ستأكل بعضها البعض ، مع بقاء يرقة دهنية واحدة فقط لكل قارورة! استمر في فحص القوارير التي لم تحتوي على يرقات لمدة 3 أيام في الأسبوع. إذا لم تظهر يرقات بعد 7-10 أيام ، فتخلص من القارورة أو خزنها لغسل القارورة. 5. صنع الطعام ملاحظة: يجب أن تكون جميع المكونات الغذائية خالية من المبيدات! استخدم ملعقة كبيرة لقياس المكونات التالية من حيث الحجم وإيداعها في مقلاة معدنية أو زجاجية (على سبيل المثال ، صينية خبز معدنية مقاس 8 بوصات × 8 بوصات): 4 أجزاء من قش الشوفان (8 ملاعق كبيرة) ، جزءان من مسحوق فطر شيتاكي (4 ملاعق كبيرة) ، 1 جزء من مسحوق السبانخ (2 ملعقة كبيرة) ، 1 جزء من مسحوق نبات القراص (2 ملعقة كبيرة). استخدم ملعقة كبيرة لخلط المكونات جيدا في المقلاة.ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام 2 أجزاء من مسحوق السبانخ فقط أو مسحوق نبات القراص فقط بدلا من 1 جزء من كل منهما. غطي المقلاة بورق الألمنيوم والأوتوكلاف في دورة جافة لمدة 20-30 دقيقة. اتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة طوال الليل أو لفترة أطول. أخرجي ورق القصدير من المقلاة وفككي خليط الطعام المعقم المتكتل ، باستخدام حركة طحن مع ملعقة كبيرة لعمل خليط مسحوق. أضف 1 جزء (2 ملعقة كبيرة ممتلئة) من خميرة البيرة واخلطها جيدا في خليط الطعام المعقم.ملاحظة: لا يتم تعقيم خميرة البيرة لأن ذلك سيقتل الخميرة. انقل خليط الطعام إلى برطمان معقم مغطى.ملاحظة: يمكن استخدام نفس النوع من جرة 240 مل المستخدمة في التزاوج الجماعي ، وسوف تملأ الوصفة أعلاه الجرة. وبالمثل ، يجب ملء نفس النوع من الجرة المعقمة المغطاة بالقش فقط الذي تم تعقيمه في مقلاة مغطاة بورق الألمنيوم. 6. التغذية ملاحظة: اضبط كمية الطعام المعطاة وفقا لعمر وكمية اليرقات. إعطاء الكثير من الطعام للجرار مع العديد من اليرقات من التزاوج الجماعي. أعط فقط رشة خفيفة من الطعام لأطباق بتري مع اليرقات التي يتم تخزينها لبضعة أيام من أجل التدريج التنموي. تم تطوير طريقة التغذية الموضحة أدناه في مختبر Charles Metz 29 ، وقد استخدمها مختبره وهيلين كروس وسوزان جيربي وآخرون بنجاح لمدة قرن. اغسل يديك واشطفهما جيدا لإزالة الصابون.ملاحظة: لا ينصح باستخدام القفازات لأنها تقلل من ملمس أصابعك لتنظيم كمية الطعام المقدمة لكل قارورة. قم بتخزين جرة معقمة مغطاة مع قش مطحون وجرة معقمة مع الطعام في الحاضنة (على سبيل المثال ، 21 درجة مئوية) حيث يتم الاحتفاظ باليرقات. قم بإزالة الغطاء من البرطمان واسكب بعض الطعام في وعاء نظيف (على سبيل المثال ، طبق حلوى) لتسهيل الوصول إليه ؛ استبدل الغطاء الموجود على الجرة التي تحتوي على الطعام المتبقي. الحفاظ على وعاء مفتوح مع الطعام في صينية معدنية أو زجاجية صغيرة. هذا سيمنع العث أو الحشرات الأخرى من الزحف فوق جدار الدرج لدخول الوعاء مع الطعام. التقط بعض الطعام بين الإصبعين الثاني والثالث (أو بين الإبهام والإصبع الثاني). من ناحية أخرى ، قم بإزالة قارورة من الدرج وإزالة القابس ، مع الاحتفاظ بها بالأصابع أثناء الرضاعة. افحص القارورة لمعرفة عمر وعدد اليرقات وقم بإيداع الكمية المناسبة من الطعام في القارورة عن طريق تدوير الإصبعين اللذين يحملان الطعام ضد بعضهما البعض. القوارير مع اليرقات الناشئة حديثا تحتاج فقط إلى بضع حبات من الطعام. يجب أن تحتوي القوارير ذات اليرقات القديمة على طبقة رقيقة من الطعام تغطي الجزء العلوي من الأجار. إذا كان هناك قالب أبيض في القارورة ، فاستخدم 70٪ من الإيثانول الذي تم رشه على منديل المختبر لتنظيف مسبار معدني طويل (على سبيل المثال ، بمقبض خشبي) ، وقم بإزالة القابس ، وأدخل المسبار النظيف في القارورة للنقر على القالب على سطح أجار. إذا كان هناك الكثير من العفن ، فقم بتدوير المسبار لف القالب حول المسبار لإزالته من القارورة. لا تزعج الجزء العلوي من أجار لأن اليرقات تعيش هناك ؛ أضف كمية صغيرة من الطعام واستبدل القابس في القارورة. امسح المسبار نظيفا بمنديل مختبر مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل تخزين المسبار أو استخدامه لتنظيف قارورة أخرى. بمجرد تغذية جميع القوارير الموجودة في صينية ، استبدل الدرج في الحاضنة وأزل الدرج التالي للتغذية كما في الخطوة 6.3. بعد اكتمال التغذية ، صب الطعام المتبقي من الوعاء في الجرة المعقمة مسبقا ، وقم بتغطية الجرة وتخزينها في الحاضنة. 7. جمع اليرقات أو الشرانق على لوحات بتري بالنسبة للأعداد الصغيرة من اليرقات ، استخدم مسبارا معدنيا أو ملعقة تم مسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول للحفر في الطبقة العليا من الآجار في قنينة لنقل الآجار الملتصق مع بعض اليرقات إلى طبق بتري معقم قطره 100 مم نصف مملوء بأجار 2.2٪ (بالوزن / المجلد). بالنسبة للأعداد الأكبر من اليرقات ، أدخل ملعقة على طول الجدار في الجزء السفلي من القارورة لتخفيف سدادة الآجار من القارورة وإيداعها وجها لأعلى في طبق بتري فارغ. استخدم مجهرا تشريحيا للعثور على اليرقات في الجزء العلوي من سدادة الآجار ونقلها بملقط دقيق الرأس إلى طبق بتري معقم بقطر 100 مم نصف مملوء بأجار 2.2٪ (بالوزن / المجلد). استخدم مجهر تشريح لفرز اليرقات بالملقط ذي الرؤوس الدقيقة إلى مجموعات من نفس مرحلة النمو.ملاحظة: بسبب عدم التزامن الطفيف في النمو ، سيكون هناك عدة مجموعات مختلفة من اليرقات المصنفة على صفيحة بتري مع 2.2٪ (بالوزن / المجلد) أجار. أضف رشة صغيرة من الطعام وضع طبق بتري مع اليرقات في الحاضنة. قم بإزالته يوميا للمراقبة باستخدام مجهر التشريح لاختيار المرحلة التنموية المطلوبة.ملاحظة: بالنسبة لدراسات نفخة الحمض النووي ، تستمر يرقات بقعة العين المبكرة خلال مراحل 10 × 5 ، 12 × 6 ، 14 × 7 ، وحافة العين / الفك المتساقط مع ~ يوم واحد في كل مرحلة من هذه المراحل 30،31. اختر الشرانق التي تمتلئ عيونها من 1/4 إلى 1/2 بالصبغة للحصول على مرحلتي الانقسام الاختزالي الأول والثاني في الخصيتين العذراء. 8. تخزين غرفة التبريد من اليرقات كنسخة احتياطية ، احتفظ في الغرفة الباردة بحوالي أربع قوارير من يرقات الإناث وأربع قوارير من يرقات الذكور من 2 أسابيع متتالية من الصلبان. لتخزين النسخ الاحتياطي ، قم بتغذية اليرقات التي تكون في وقت مبكر من 4عشر instar (مرحلة ما قبل بقعة العين) ووضعها في صينية مفتوحة على رف في الغرفة الباردة ؛ إطعام هذه القوارير مرة واحدة فقط في الشهر. إزالة 16 قارورة من أسبوعين متتاليين من الصلبان التزاوج من البرد بعد 2-3 أشهر (ضع علامة على هذا في التقويم كتذكير) ؛ ضعهم في حاضنة (على سبيل المثال ، 21 درجة مئوية) لإطعامهم بشكل طبيعي والسماح لهم بالتطور إلى بالغين لاستخدامها في الصلبان. عندما تتم إزالة القوارير من الغرفة الباردة ، ضع مجموعة جديدة من القوارير مع يرقات4 في وقت مبكر في الغرفة الباردة بحيث تكون هذه القوارير متاحة دائما كنسخة احتياطية للمخزون.ملاحظة: لم يتم اختبار الصلاحية بعد تخزين الغرفة الباردة بشكل منهجي لمراحل النمو المختلفة ، لكن تجربتنا تكشف أن التخزين البارد لليرقات المبكرة4 th instar يعمل بشكل جيد. 9. غسل القارورة بعد وفاة البالغين (~ 2-3 أسابيع بعد الإغلاق) ، قم بإزالة القوارير من الحاضنة وضعها في 60-70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لقتل أي كائنات متبقية. قم بإزالة سدادات القطن وتخزينها في صندوق بلاستيكي. استخدم ملعقة لكشط سدادة أجار من القارورة إلى سلة نفايات. انقع القوارير طوال الليل أو لفترة أطول مغمورة في الماء في صحن. استخدم فرشاة أنبوب اختبار محفوظة لهذا الغرض فقط (لم تستخدم أبدا للأوعية التي تحتوي على مواد كيميائية ولا بالصابون) وافركها لأعلى ولأسفل في القارورة تحت ماء الصنبور الجاري. ضع القارورة النظيفة مفتوحة من الجانب لأسفل في سلة معدنية. املأ السلة بقوارير نظيفة.ملاحظة: لا تستخدم الصابون أبدا في القوارير لأن أي صابون متبقي يمكن أن يقتل B. coprophila. أضف غطاء شبكي سلكي إلى السلة ، وأثناء تثبيت الغطاء في مكانه ، اقلب السلة لملء جميع القوارير بالماء منزوع الأيونات. مع الاستمرار في تثبيت الغطاء في مكانه ، اقلب السلة لتفريغ الماء منزوع الأيونات من القنينات. كرر شطف الماء منزوع الأيونات 4x. ضع السلال مع قوارير نظيفة على مناشف ورقية أو منصة شبكية مفتوحة (على سبيل المثال ، عربة المختبر) لتجف طوال الليل أو لفترة أطول. قم بتخزين القوارير الجافة في درج.ملاحظة: لا تدع القوارير التي تحتوي على بالغين ميتين تبقى لفترة طويلة قبل غسلها لأنها قد تؤدي إلى غزو العث. 10. صب أجار املأ وعاءا كبيرا (سلة معدنية أو صينية معدنية) بقوارير نظيفة وأضف سدادة قطنية إلى كل قارورة. أعد استخدام المقابس المأخوذة من القوارير القديمة عند غسل القوارير ، واستخدم المقابس بشكل متكرر حتى تتحلل وتتفتت ويجب التخلص منها. تعقيم الحاوية مع قوارير موصولة في دورة جافة لمدة ~ 30 دقيقة واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لتخزينها في حاوية الأوتوكلاف. احتفظ دائما بحاويتين (واحدة قيد الاستخدام النشط والأخرى احتياطية) مع قوارير موصولة بالتعقيم في متناول اليد. ضع 11.0 جم من مسحوق أجار في دورق Erlenmeyer سعة 1 لتر وأضف 500 مل من الماء المقطر لصنع محلول أجار 2.2٪ (بالوزن / المجلد) يكفي لصب ~ 24 قارورة (~ 21 مل / قارورة). حرك القارورة وضعها في فرن الميكروويف.ملاحظة: من الآن فصاعدا ، استخدم قفاز الأوتوكلاف المقاوم للحرارة للتعامل مع القارورة. يمكن سكب نفس محلول أجار 2.2٪ (بالوزن / المجلد) في ألواح بتري (لليرقات المقطوفة) أو الجرار (للتزاوج الجماعي) إذا لزم الأمر. الميكروويف لمدة 1 دقيقة ، وإزالة القارورة لتحريكها ، واستبدالها في فرن الميكروويف ، ووضعها في الميكروويف مرة أخرى لمدة 1 دقيقة. كرر هذا عدة مرات. شاهد القارورة من خلال الباب الزجاجي لفرن الميكروويف. عندما يبدأ محلول أجار في الرغوة ويغلي ، استخدم زر التوقف اليدوي على الفور. لا تقم بتدوير القارورة في هذه المرحلة (يمكن أن تغلي) ، وقم بإزالتها بعناية من الفرن إلى المنضدة واتركها ترتاح لبضع دقائق. أخرج القابس من قارورة معقمة وأمسكها بيد واحدة ؛ استخدم اليد الأخرى لصب ~ 2.5 سم عالية 2.2٪ أجار في القارورة المعقمة. ثم استبدل القابس في القارورة. كرر هذا حتى يتم سكب كل أجار.ملاحظة: إذا تم سكب القليل جدا من الآجار في القارورة ، فسوف يجف بسرعة أكبر أثناء الاستخدام ويتقلص بعيدا عن جدران القارورة. إذا تم سكب الكثير من الآجار في القارورة ، فمن الصعب التركيز على الطبقة العليا عند تسجيل “فتحة الطفل” لليرقات باستخدام مجهر تشريح. دع القوارير المصبوبة تبقى على المنضدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 أيام حتى يصلب الآجار وتتبخر الرطوبة تماما. استخدم القوارير لتزاوج الصلبان أو قم بتخزينها ملقاة على جانبها في صندوق بلاستيكي بغطاء محكم ؛ ضع منشفة ورقية مبللة بالماء فوق القوارير قبل وضع الغطاء على الصندوق (سيمنع ذلك الآجار من الجفاف والانكماش بعيدا عن جدار القارورة). قم بتخزين الصندوق مع قوارير مصبوبة في درجة حرارة الغرفة لبضعة أيام أو في ثلاجة 4 درجة مئوية أو غرفة باردة لمدة تصل إلى 2 أسابيع. قبل استخدام القوارير المخزنة ، أخرجها من الصندوق واتركها على المنضدة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أو ساعتين للسماح للتكثيف بالتبخر من داخل القوارير (يلتصق الذباب البالغ بالمكثفات ويغرق). 11. صنع المقابس للقوارير ضع قنينة نظيفة في حامل أنبوب اختبار الستايروفوم سعة 50 مل (ادفع الأنبوب للداخل حتى يقف بشكل مستقيم). قطع مربع من القماش القطني (2-4 طبقات سميكة) ووضعه فوق القارورة. ضع قصاصات من القماش القطني من المقابس المصنوعة مسبقا فوق القماش القطني لإنشاء طبقة أكثر سمكا. ضع القطن فوق القماش القطني واضغط لأسفل في القارورة ، مع التأكد من ملء البوصة العلوية أو نحو ذلك من القارورة بإحكام. امسك الجزء العلوي من نهايات القماش القطني معا واربطه بخيط. اقطع الخيط الزائد والقماش القطني الزائد (اترك ذيولا كافية من الخيط لإبقائه مربوطا وقطعة قماش قطنية كافية للإمساك بالقابس بشكل مريح).ملاحظة: قم بتركيب المقابس بحيث تكون دافئة. يجب أن تكون قادرا على سحبها بالسبابة والسبابة أثناء حملها بيد واحدة. إذا التقطت القارورة من القابس وسقطت ، فهي فضفاضة للغاية. إذا كان يصدر صوت فرقعة عاليا عند سحبه ، فقد يكون ضيقا جدا. إذا كان ضيقا جدا أو إذا كان القابس يحتوي على طبقة من الآجار الصلب والجاف ، فقد يختنق الذباب. إذا كان القابس فضفاضا جدا أو ينزلق على جوانب القارورة ، فيمكن النقر عليه على سطح العمل لسحقه إلى حجم أوسع قليلا. 12. جدول أسبوعي نموذجي (لتحقيق أكبر قدر من الكفاءة ، قم بتنفيذ المهام بالترتيب المدرج) الاثنين (~30 دقيقة)تغذية قوارير مع اليرقات. صب أجار في قوارير نظيفة معقمة مع المقابس. الأربعاء (~2 ساعة)ضع قوارير مع البالغين الميتين في فرن لمدة 1 ساعة وتخزينها للغسيل. تحقق من اليرقات “طفل يفقس”. تغذية قوارير مع اليرقات. أداء الصلبان التزاوج الأسبوعية. واجبات أخرى حسب الحاجة: قوارير الأوتوكلاف النظيفة مع المقابس للحصول على إمدادات احتياطية حسب الحاجة ؛ صنع طعام جديد وقش الأوتوكلاف حسب الحاجة ؛ الجرار الأوتوكلاف حسب الحاجة للطعام والقش. الجمعة (~30 دقيقة)تحقق من اليرقات “طفل يفقس”. تغذية قوارير مع اليرقات.

Representative Results

أدت البروتوكولات الموصوفة هنا إلى نجاح مثبت في تربية B. coprophila. عندما يتم اختيار البالغين الدهنيين المغلقين مؤخرا للتزاوج (الشكل 4) ، يمكن أن يكون أكثر من 90٪ من الصلبان خصبا وينتج ذرية. يختلف نجاح الخصوبة باختلاف المخزونات (الجدول 2). كان المخزون 7298 (كروموسوم X مع علامة متموجة) هو الأكثر صحة بين الأسهم ولكنه مر بفترة من الانخفاض ، على ما يبدو بسبب تنشيط عناصر الحمض النووي المتنقلة التي أدت إلى إعادة ترتيب الجينوم32. يمثل مخزون HoLo2 سلالة صحية مشتقة من 7298 ، حيث يبدو أن إعادة ترتيب الجينوم قد استقرت ، وقد حلت محل مخزون الوالدين 7298 في مركز المخزون. مخزون HoLo2 هو الذي تم استخدامه لتسلسل جينوم B. coprophila وهو الأكثر استخداما على نطاق واسع من قبل مجموعات المختبرات المختلفة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طفرات كريسبر لذباب HoLo2 لإنشاء مخزون W14 مع النمط الظاهري للعين البيضاء لاستخدامه في التحول باستخدام علامات العين الفلورية (Yamamoto و Gerbi ، البيانات غير معروضة). سلالة W14 قوية بشكل استثنائي. مخزون 6980 (الجناح المتموج وعلامات الوريد المنتفخة) أقل قوة إلى حد ما وسهم 91S (علامة الجناح الصغيرة) أقل قوة. ينتج عن التهجين الناجح أجنة (الشكل 5). تخضع الأجنة للقضاء على كروموسومات X الأبوية المطبوعة في تقسيم الانقسام من7 إلى 9. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التخلص من كروموسومات L المحدودة للخط الجرثومي من السلالة الجسدية في الأجنة فيقسم الانقسام من 5 إلى 6. تظهر الأجنة على شكل يرقات، والتي لا ينبغي الخلط بينها وبين العفن الذي قد يكون موجودا أيضا (الشكل 6). تظهر بقع العين (anlage لعيون البالغين) في النصف الثاني منالنجم اليرقي الرابع (الشكل 7). يوفر حجم بقع العين علامة مظهرية ملائمة لبداية وتطور تضخيم نفخة الحمض النووي ، وهو واحد من مثالين معروفين فقط لتضخيم الحمض النووي (الجين) داخل الكروموسومات المنظم بشكل طبيعي والخاص بالموقع. بعد ذلك ، تتطور الشرانق ، ويمكن أن تكون كمية الصبغة التي تملأ عيونهم بمثابة علامة تنموية للانقسام الميوزي الأول والثاني في تكوين المنوية (الشكل 8) بسلوكياتها الكروموسومية الفريدة في هذه الانقسامات. الشكل 4: تزاوج ذباب B. coprophila البالغ. تظهر اللوحة العلوية الأنواع الثلاثة من الذباب البالغ في مخزون HoLo2: الأمهات المنتجات للإناث ذوات الأجنحة المتموجة (الإناث البالغات X’WX) ، والأمهات المنتجات للذكور بأجنحة مستقيمة (XX من الإناث البالغات) ، والذكور ذات الأجنحة المستقيمة (X0 من الذكور البالغين). لاحظ ovipositor مدبب في الطرف الخلفي من الذباب الإناث والمشبك على شكل خطاف في الطرف الخلفي من الذباب الذكر. تظهر اللوحة السفلية تزاوج ذكر وأنثى ، حيث أمسك المشبك الذكر ببيضة الأنثى. سيتم تخزين المنوية في المنوية للإناث وسوف تخصب البويضات عند تصريفها إلى الخارج. طول البالغين 2.0 ملم (ذكور) ، 2.5 ملم (إناث). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: ب. أجنة كوبروفيلا. اللوحة العلوية اليسرى هي منظر للأجنة باستخدام الضوء القياسي في مجهر تشريح. تظهر النوى في السيتوبلازم المخلوي كنقاط سوداء. تستخدم اللوحة الموجودة على اليمين الفحص المجهري الفلوري لتصور نوى الأجنة الملطخة بيوديد البروبيديوم. يبلغ متوسط طول الأجنة 200 ميكرون ومتوسط عرضها 150 ميكرون. تتجمع نوى الخلايا الجرثومية في القطب الخلفي للجنين كما يظهر في الدورات 6 (يميل الجنين للأمام) ، و 7-9 ، وبعد ذلك تتخللها نوى جسدية. يحدث التخلص من كروموسوم L في السلالة الجسدية في تقسيم الانقسام 5 أو 6 ؛ يحدث التخلص من كروموسوم X في السلالة الجسدية في تقسيم الانقسام7 أو 8 أو 9. يحدث النسيج الخلوي خلال الطور البيني للدورة 11. يوضح الجدول الموجود على اليسار متوسط المدة الزمنية لكل دورة تقسيم عند 22 درجة مئوية. تم تكييف الطاولة الموجودة على اليسار واللوحة الموجودة على اليمين بإذن من de Saint Phalle و Sullivan35. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: تظهر أجنة B. coprophila في صورة يرقات. تظهر مجموعة من الأجنة (سهم سميك أزرق) بالقرب من ovipositor للإناث البالغة التي ماتت بعد وضع البيض. بعد أسبوع من وضع البيض ، تصبح الأجنة يرقات شابة ، يشار إلى العديد منها بالأسهم السوداء. اليرقات الناشئة حديثا لها فك أسود في الطرف الأمامي وجسم شفاف. تتحرك فوق سطح أجار ويجب عدم الخلط بينها وبين العفن الذي لا يتحرك. يظهر الجزء الداخلي بعض العفن ، مع خيوط بيضاء (سهم أحمر) وبوغ أسود في طرفه (سهم أخضر) ، وهو أصغر قليلا جدا من اليرقات الناشئة حديثا. شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 7: مراحل بقعة العين ليرقات B. coprophila . تتشكل بقع العين في الجزء الأمامي من اليرقة ، خلف الفك مباشرة ، وتتكون من حبيبات صبغية يزداد عددها. بقع العين هي anlage للعين البالغة. تظهر اللوحة العلوية اليرقات التي تم تصورها باستخدام مجهر تشريح. اللوحة السفلية عبارة عن منظر مكبرة لبقع العين باستخدام مجهر تباين الطور لتصور يرقة على شريحة مجهرية مع قطرة من الماء المقطر وغطاء يطفو برفق في الأعلى. يتم تسمية مراحل بقعة العين وفقا ل Gabrusewycz-Garcia30 حيث يتم حساب عدد الحبيبات في أطول صف (على سبيل المثال ، 12) ويتم ملاحظة عدد الصفوف الإضافية باستثناء أطول صف (على سبيل المثال ، 6 لمرحلة بقعة العين 12×6). يبدأ بدء تضخيم الحمض النووي الخاص بالموقع في كروموسومات بوليتين الغدد اللعابية في مرحلة بقعة العين 10 × 5 ويكتمل عند 14 × 7 عندما يكون هناك انفجار في النسخ في موضع وتوسع نفث الحمض النووي31. في مرحلة الحافة اللاحقة / الفك المتساقط ، تبدأ حبيبات بقعة العين في الاندماج ، وتتحرك بشكل جانبي بعيدا عن خط الوسط. طول الجسم اليرقات يقصر. علاوة على ذلك ، تتكثف نفث الحمض النووي في هذه المرحلة. يستغرق الأمر حوالي يوم واحد عند 21 درجة مئوية لاجتياز كل مرحلة من مراحل بقعة العين. شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 8: تطور الشرانق B. coprophila . أثناء التشرد ، تتحلل جميع أنسجة اليرقات باستثناء الجهاز العصبي ويتم استبدالها بأنسجة بالغة تنشأ عن طريق انقسامات الخلايا في الأقراص الوهمية. يتغير لون الجسم من الأبيض إلى الأسمر إلى البني إلى الأسود. الصباغ يملأ تدريجيا في العين العذراء. يحدث الانقسام الاختزالي الأول والثاني في ذكور الشرانق ذات العيون التي تمتلئ بالصباغ36. شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. اسم السهم علامات معدل الخصوبة التعليقات 7298 الجناح المتموج (W) ~ 75٪ هولو 2 الجناح المتموج (W) ~ 90٪ مشتقة من 7298 دبليو 14 الجناح المتموج (W) ؛ عيون بيضاء ~ 95٪ مشتقة من HoLo2 6980 الجناح المتموج (W) ؛ تورم الأوردة (SW) ~ 65٪ 91 ثانية جناح متموج ضعيف (W) ؛ أجنحة صغيرة (P) ~ 50٪ تم تقديم علامة متموجة في صليب لإنقاذ 91S الجدول 2: مخزونات براديسيا (Sciara) coprophila. يسرد الجدول 1 من Gerbi6 هذه العلامات وغيرها التي لم تعد موجودة. تم تلخيص خمسة عمليات نقل (T1 ، T23 ، T29 ، T32 ، T70) في نهاية السنترومير من X27 في الشكل 8 من Gerbi6 ولكنها لم تعد موجودة. الملف التكميلي 1: الصلبان HoLo2 (و 7298 و W14) ، 91S عبر والإنقاذ ، 6980 تقاطع ، عبور النقل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

ستكون البروتوكولات المقدمة هنا لتربية B. coprophila مفيدة للعلماء الذين يرغبون في رفع هذا الكائن الحي في مختبراتهم لإجراء تجارب للتعمق في خصائصه البيولوجية الفريدة. تم استخدام الوصف الأولي لطريقة التغذية باستخدام الخميرة ومسحوق الفطر المرشوش على قاعدة أجار للحفاظ على B. coprophila²⁹ في مختبر ميتز لتربية 14 نوعا مختلفا من الذباب Sciarid⁵. في وقت لاحق ، لوحظ أن إضافة نبات القراص و / أو مسحوق السبانخ زاد من حيوية B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia ، التواصل الشخصي). وقد نجحت هذه الطرق في الحفاظ على الأنواع ذات الصلة داخل عائلة Sciaridae ، بما في ذلك Bradysia impatiens و Lycoriella ingenua الموجودة حاليا في الاستزراع (روبرت بيرد ، التواصل الشخصي).

تمت تجربة طرق أخرى (مثل طرق التغذية البديلة الموضحة أدناه) لرفع B. coprophila ، ولكن تم تحسين البروتوكولات الموضحة هنا للحصول على أفضل نسبة من اليرقات لكل مساحة سطح من أجار للحصول على البالغين الأكثر خصوبة من الدهون وتقليل نمو العفن. لتوسيع النطاق ، يمكن إجراء التزاوج الجماعي في قوارير زجاجية كما هو موضح في البروتوكول 2 أعلاه. بدلا من ذلك ، يمكن وضع عدد قليل (2-4) من الإناث البالغات مع ضعف عدد الذكور البالغين في قارورة مثل تلك المستخدمة لرفع ذبابة الفاكهة (يمكن التخلص منها 6 أونصات = 177.4 مل زجاجة بولي بروبيلين ذبابة الفاكهة ذات القاع المربع). في كلتا الحالتين ، يجب أن يكون الباحث واثقا تماما من أن القارورة تحتوي فقط على جميع الإناث المنتجات أو جميع الأمهات المنتجات الذكور.

إطعام اليرقات فقط لأن الشرانق والبالغين لا يأكلون. لا تطعم القارورة إذا تحولت اليرقات إلى الشرانق (علامة على ذلك عندما تظهر أول ذباب بالغ مبكر الظهور). بمجرد إغلاق البالغين ، ضع القوارير في حاضنة أكثر برودة (على سبيل المثال ، 16 درجة مئوية) إذا كانت متوفرة لأن هذا سيسمح للبالغين بالعيش لفترة أطول. قم بالتغذية ثلاث مرات في الأسبوع (على سبيل المثال ، الاثنين والأربعاء والجمعة) ، مما يزيد من كمية الطعام المعطاة لكل قارورة مع تقدم اليرقات في السن. إطعام بسخاء ، وسوف تكافأ مع البالغين الدهون الخصبة. ومع ذلك ، إذا كنت تتغذى كثيرا ، فسيظهر العفن الأبيض وهذه علامة لتقليل كمية الطعام التي تودعها في قارورة. علاوة على ذلك ، إذا كنت تتغذى أكثر من اللازم ، فسوف تتطور وسادة سميكة من الطعام فوق الآجار وتجعل من الصعب على البالغين الظهور (يمكنك إزالة الوسادة بالملقط ، ولكن احرص على عدم إخراج اليرقات باستخدام الوسادة – من الأفضل عدم القيام بذلك على الإطلاق). تحتاج القوارير التي تحتوي على عدد قليل من اليرقات (التي تحمل علامة “قليلة”) إلى طعام أقل. إذا كنت تتغذى قليلا جدا ، فإن اليرقات ستتسلق جدران القارورة بحثا عن الطعام. تؤدي اليرقات التي تعاني من نقص التغذية إلى بالغين صغار أقل خصوبة.

طرق التغذية البديلة
تمت محاولة مجموعة متنوعة من الطرق لتغذية اليرقات مرة واحدة فقط خلال مرحلة اليرقات بدلا من 3 مرات في الأسبوع. لن تنمو B. coprophila على طعام نمط ذبابة الفاكهة . حاول جون أوربان (اتصال شخصي) خلط طعام B. coprophila مع الأجار ، لكن الكثير من العفن نما. وجد أن إضافة اثنين من مثبطات العفن (tegosept وحمض البروبيونيك) في تركيبة وبشكل منفصل ، وتجربة عدة تركيزات مختلفة ، كانت جميعها سامة ل B. coprophila عند مستويات تمنع العفن. يجب أن يكون الآجار درجة الحموضة 6-7 (محايد) حيث يمرض B. coprophila عند درجة الحموضة الحمضية (كما هو الحال مع حمض البروبيانيك). بدلا من ذلك ، لتجنب التغذية ثلاث مرات أسبوعيا ، حاول استخدام ملعقة أو حقنة بدون إبرة لتوزيع معجون خميرة سميك (خميرة ريد ستار الجافة النشطة الممزوجة بقليل من الماء المقطر لترطيبها) كدمية فوق الآجار في كل قارورة بعد أسبوع واحد من التزاوج (أي في الوقت الذي ستبدأ فيه اليرقات في الظهور).

هناك طريقة أخرى لتجنب التغذية الأسبوعية ثلاث مرات وهي إضافة ثقافة حية من الفطريات إلى كل قارورة. أفاد Bath and Sponsler³⁷ أن سطح أجار مائل مع وسط Sabouraud يجب أن يكون مخططا بزراعة فطرية من أجناس Chaetoconidia (الأفضل) أو Baplosporangia أو Xllescheria. نمت الفطريات قبل عدة أيام إلى أسبوع واحد من إدخال B. coprophila . لم تكن هناك حاجة للتغذية بعد هذا. كما تم استخدام متغير من هذه الطريقة من قبل إلين راش (التواصل الشخصي). في أيدينا ، كانت القوارير مبللة جدا بهذه الطريقة وغرقت اليرقات ، ولكن يمكن تجربتها مرة أخرى لتحسين عدد اليرقات بالنسبة للقوارير مع الفطريات الحية.

حقق آرثر فورير (التواصل الشخصي) بعض النجاح في تربية B. coprophila بنفس الطريقة التي يطير بها طائر الكركي³⁸. مع هذا النهج ، تم تربية الشرانق على الورق المعجن الرطب. بعد ذلك ، تم تزاوج البالغين وتم إيداع البيض على الورق المعجن الرطب الطازج. تم الاحتفاظ باليرقات الناتجة على الورق المعجن في أطباق بتري وتغذيتها بأوراق نبات القراص المسحوق مرتين في الأسبوع. تم وضع الشرانق في قفص لتكرار الدورة.

حاولت Yukiko Yamashita (التواصل الشخصي) دون نجاح تربية B. coprophila على التربة ، محاكيا الظروف التي توجد فيها في الطبيعة في أصص النباتات والدفيئات ذات الرطوبة العالية. ومع ذلك ، يمكن أن يصبح العفن مشكلة عند رفع مستوى الرطوبة. ومع ذلك ، فقد تم استخدام التربة الرطبة بنجاح لتربية يرقات Pseudolycoriella (Bradysia سابقا) hygida في صناديق بلاستيكية ذات تربة رطبة. يتم تغذيتها بأوراق Ilex paraguariensis المتحللة ، وتستكمل في أواخر حياة اليرقات بمستخلص الخميرة بنسبة 1.2٪ ، 1.4٪ نشا الذرة ، 0.8٪ دقيق الشوفان ، 1.2٪ أجار¹². وبالمثل ، يمكن استبدال التربة الرطبة بطحلب الخث الرطب مع الفاصوليا المسحوقة لرفع الذباب Sciarid ^39,40.

ومع ذلك ، تم استخدام طرق أخرى للحفاظ على المزارع المختبرية لبراديسيا: (أ) البطاطس المعقمة التي تضاف إليها الخميرة وسماد الدم^{المجفف 41} ؛ (ii) السماد⁴²^،⁴³^،⁴⁴ الذي يمكن إضافة الدم المجفف إليه⁴⁵ ؛ (iii) حاويات بلاستيكية مع ضمادات قطنية ومناشف ورقية مبللة مع فول الصويا المطحون⁴⁶.

العث
يمكن نقل العث من ذبابة الفاكهة إلى B. coprophila. لتقليل ذلك ، من الأفضل الاحتفاظ ب B. coprophila في حاضنة أو غرفة منفصلة ، وليس بالقرب من مخزون ذبابة الفاكهة . علاوة على ذلك ، قم بأي أعمال صيانة B. coprophila في وقت مبكر من اليوم قبل التعامل مع ذبابة الفاكهة. يمكن أيضا نقل العث إلى B. coprophila من النباتات المنزلية ، لذلك لا تحتفظ بالنباتات في نفس الغرفة مثل B. coprophila. إذا غزت العث القوارير ، فيمكن رؤيتها ككائنات كروية بيضاء صغيرة تزحف على جسم B. coprophila. لا يمكن استخدام المعالجات الكيميائية التي تعمل على تدمير العث في ذبابة الفاكهة ل B. coprophila لأن المواد الكيميائية تقتل B. coprophila (B. coprophila حساسة أيضا للأبخرة العضوية مثل الفينول). العلاج الوحيد لتخليص مخزون B. coprophila من العث هو جمع الأجنة يدويا على صفيحة أجار ، وفحص كل منها لعدم وجود عث ، ثم نقلها إلى قوارير أجار طازجة باستخدام فرشاة طلاء دقيقة. تساعد سدادات الشاش المملوءة بالقطن وقشور رغوة أسيتات السليلوز (كما هو مستخدم في قوارير البولي بروبيلين ذبابة الفاكهة ) على منع دخول العث إلى القوارير.

فائدة بروتوكولات التربية
ستمكن البروتوكولات الموصوفة هنا مجتمع العلماء المتنامي من تربية B. coprophila ككائن نموذجي جديد / قديم ناشئ لدراسة سماته البيولوجية الفريدة. يتم تشجيع مجموعات المختبرات الجديدة على الانضمام إلى المجتمع المتنامي للحفاظ على السمات البيولوجية الفريدة ل Bradysia (Sciara) والتحقيق فيها.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

شكر خاص لحفظة مخزون B. coprophila السابقين (جاكوب إي بليس ، بولا بونازينجا ، آن دبليو كيريبروك ، إنغريد إم ميرسر ، هايدي إس سميث) وموظفي البحث (خاصة روبرت بيرد ، مايكل س. فولك ، دونا كوباي ، جون إم أوربان ، يوتاكا ياماموتو) لضبط بروتوكولات التربية. تم تقديم التعليمات الأولية حول رعاية B. coprophila من قبل هيلين ف. كروس ، وناتاليا غابروسفيتش غارسيا ، وريبا إم جودمان ، وتشارلز دبليو ميتز ، وإلين راش. مع الامتنان ليوكيكو ياماشيتا وآن دبليو كيريبروك لتوليهما مركز أسهم Bradysia (Sciara). الكثير من التقدير للأشخاص التالية أسماؤهم لإعدادهم المفيد للشخصيات: بريان ويجمان (الشكل 1) ، جون إم أوربان (الشكل 4 اللوحة العلوية) ، لورا روس (الشكل 4 اللوحة السفلية) ، يوتاكا ياماموتو (الشكل 5 اللوحة اليسرى) ، ليو كادوتا (الشكل 7 والشكل 8). شكرا جزيلا لآفا فيليس ومختبر جامعة براون متعدد التخصصات لمساعدتهم في التصوير الفوتوغرافي والتصوير. شكرا لروبرت بيرد على تعليقاته على هذه المخطوطة. تم دعم أبحاثنا وصيانتها ل B. coprophila من قبل المعاهد الوطنية للصحة و NSF ، بما في ذلك أحدث دعم من GM121455 المعاهد الوطنية للصحة إلى SAG يتوفر مزيد من التفاصيل حول B. coprophila على مواقع مركز Bradysia (Sciara) Stock Center (https://sites.brown.edu/sciara/ و https://sciara.wi.mit.edu) التي يتم إنشاؤها حاليا.

Materials

Agar (bacteriological)	U.S. Biological	A0930	https://www.usbio.net;
CO₂ FlyStuff Foot Pedal	Genesee Scientific	59-121
CO2 FlyStuff Blowgun	Genesee Scientific	54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypad	Genesee Scientific	59-172	https://www.geneseesci.com
Ether fume hood	Labconco	3955220	Sits on top of lab bench
			Filter replacement cat # 6961300
Food: Brewer’s Yeast Powder	Solgar		Obtain from Amazon or health food store
			https://www.solgar.com;
Food: Nettle Powder (pesticide free)	Starwest Botanicals	209460-51
Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)	Starwest Botanicals	202127-5	https://www.starwest-botanicals.com;
Food: Spinach Powder ( pesticide free)	Starwest Botanicals	209583-5
Food: Straw (pesticide free )	Starwest Botanicals	209465-3
Jar: clear glass, polypropylene lid	Fisher Scientific:	FB02911765	73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) https://www.fishersci.com;
Needle Probe, wooden handle	US Geo Supply Inc	SKU: 4190	5.75” long probe, stainless steel needle https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
Vials: glass, preferred:	Wilmad LabGlass
Wilmad-glass custom vials			28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com
Vials: glass (cheaper and ok)	Fisher Scientific	03-339-26H	29 mm outer dia, 9.5 cm h https://www.fishersci.com;
Vials: glass (a bit narrow)	Genesee Scientific	32-201	24.5 mm outer dia,9.5 cm h thttps://www.geneseesci.com
Vials: polypropylene	Genesee Scientific	32-114	28.5 mm outer dia,9.5 cm ht
Vial Plugs
roll of non-absorbent cotton	Fisher Scientific	22-456881
cheesecloth	Fisher Scientific	22-055053	https://www.fishersci.com;

Riferimenti

Lewin, H. A., et al. Earth BioGenome project: Sequencing life for the future of life. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (17), 4325-4333 (2018).
Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (14), 5690-5695 (2011).
Yeates, D. K., Wiegmann, B. M. Phylogeny of Diptera. Manual of Afrotropical Diptera.Suricata. 3, 149-161 (2017).
Vilkamaa, P., Burdíková, N., Ševčík, J. The genus Spinopygina gen. nov. (Diptera, Sciaridae) from Western North America: Preliminary molecular phylogeny and description of seven new species. Insects. 14 (2), 173 (2023).
Metz, C. W. Chromosome behavior, inheritance and sex determination in Sciara. Amer Naturalist. 72 (743), 485-520 (1938).
Gerbi, S. A., Hennig, N. Unusual chromosome movements in Sciarid flies. Results and Problems in Cell Differentiation. Vol 13 Germ Line – Soma Differentiation. 13, 71-104 (1986).
Gerbi, S. A., Larracuente, A., Hanlon, S. Non-random chromosome segregation and chromosome eliminations in the fly Bradysia (Sciara). 34;Non-Mendelian Inheritance and Meiotic Drive.", Chromosome Research.(special issue). 30, 273-288 (2022).
Steffan, W. A. A generic revision of the family Sciaridae (Diptera) of America North of Mexico. University of California Publications in Entomology. 44, 1-77 (1966).
Shin, S., Jung, S., Menzel, F., Heller, K., Lee, H. Molecular phylogeny of black fungus gnats (Diptera: Sciaroidea: Sciaridae) and the evolution of larval habitats. Molec Phylogenetics Evolution. 66 (3), 833-846 (2013).
Mohrig, W., Heller, K., Hippa, H., Vilkamaa, P., Menzel, F. Revision of the black fungus gnats (Diptera: Sciaridae) of North America. Studia Dipterologica. 19 (1-2), 141-286 (2013).
Ševčík, J., et al. Molecular phylogeny of the megadiverse insect infraorder Bibionomorpha sensu lato (Diptera). PeerJ. 4, e2563 (2016).
Menzel, F., et al. Pseudolycoriella hygida (Sauaia and Alves)-An overview of a model organism in genetics, with new aspects in morphology and systematics. Insects. 15 (2), 118 (2024).
Meigen, J. W. . Klassifikazion und Beschreibung der europäischen zweiflügligen Insekten (Diptera Linn). 1 (1), (1804).
Johannsen, O. A. The fungus gnats of North America part I. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 172, 209-276 (1909).
Johannsen, O. A. Mycetophilidae of North America. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 200, 57-146 (1912).
Urban, J. M., et al. Bradysia (Sciara) coprophila larvae up-regulate DNA repair pathways and down-regulate developmental regulators in response to ionizing radiation. Genetica. (3), (2024).
Hodson, C. N., Jaron, K. S., Gerbi, S., Ross, L. Gene-rich germline-restricted chromosomes in black-winged fungus gnats evolved through hybridization. PLoS Biology. 20 (2), e3001559 (2021).
Urban, J. M., et al. High contiguity de novo genome assembly and DNA modification analyses for the fungus fly, Sciara coprophila, using single-molecule sequencing. BMC Genomics. 22, 643 (2021).
Baird, R. B., et al. Recent evolution of a maternally acting sex-determining supergene in a fly with single-sex broods. Mol Biol Evol. 40 (7), (2023).
Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Making ends meet: targeted integration of DNA fragments by genome editing. Chromosoma. 127 (4), 405-420 (2018).
Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Development of transformation for genome editing of an emerging model organism. Genes. 13 (7), 1108-1124 (2022).
Metz, C. W., Smith, H. B. Further observation on the nature of the x-prime (X’) chromosome in Sciara. Proc Nat Acad Sci USA. 17 (4), 195-198 (1931).
Crouse, H. V. X-ray induced sex-linked recessive lethals and visibles in Sciara coprophila. Amer Naturalist. 95 (880), 21-26 (1961).
Metz, C. W., Ullian, S. S. Genetic identification of the sex chromosomes in Sciara (Diptera). Proc Nat Acad Sci USA. 15 (2), 82-85 (1929).
Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). I. Centromere localization. Chromosoma. 63, 39-55 (1977).
Crouse, H. V., Gerbi, S. A., Liang, C. M., Magnus, L., Mercer, I. M. Localization of ribosomal DNA within the proximal X heterochromatin of Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). Chromosoma. 64 (4), 305-318 (1977).
Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). II. The controlling element. Chromosoma. 74, 219-239 (1979).
Mok, E. H., et al. Maintenance of the DNA puff expanded state is independent of active replication and transcription. Chromosoma. 110 (3), 186-196 (2001).
Smith-Stocking, H. Genetic studies on selective segregation of chromosomes in Sciara coprophila Lintner. Genetica. 21 (4), 421-443 (1936).
Gabrusewycz-Garcia, N. Cytological and autoradiographic studies in Sciara coprophila salivary gland chromosomes. Chromosoma. 15, 312-344 (1964).
Wu, N., Liang, C., DiBartolomeis, S. M., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Developmental progression of DNA puffs in Sciara coprophila: amplification and transcription. Dev Biol. 160 (1), 73-84 (1993).
Yamamoto, Y., Gustafson, E. A., Foulk, M. S., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Anatomy and evolution of a DNA replication origin. Chromosoma. 130 (2-3), 199-214 (2021).
Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
Bertone, M. A., Courtney, G. W., Wiegmann, B. M. Phylogenetics and temporal diversification of the earliest true flies (Insecta: Diptera) based on multiple nuclear genes. Syst Entomol. 33, 668-687 (2008).
de Saint Phalle, B., Sullivan, W. Incomplete sister chromatid separation is the mechanism of programmed chromosome elimination during early Sciara coprophila embryogenesis. Development. 122 (12), 3775-3784 (1996).
de Saint Phalle, B., Oldenbourg, R., Kubai, D., Salmon, E. D., Gerbi, S. A. Paternal chromosome elimination and X non-disjunction on asymmetric spindles in Sciara male meiosis. BioRxiv. , (2021).
Bath, J. D., Sponsler, O. L. An alternative method for the culture of Sciara larvae. Science. 109 (2828), 255 (1949).
Forer, A. Crane fly spermatocytes and spermatids: A system for studying cytoskeletal components. Methods Cell Biol. 25, 227-252 (1982).
Gillespie, D. R. A simple rearing method for fungus gnats Corynoptera sp. (Diptera: Sciaridae) with notes on life history. J Entomol Soc Br Colum. 83, 45-48 (1986).
Gardiner, R. B., Jarvis, W. R., Shipp, J. L. Ingestion of Pythium spp. by larvae of the fungus gnat Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae). Ann Appl Biol. 116, 205-212 (1990).
Hungerford, H. B. Sciara maggots injurious to potted plants. J Econ Entomol. 9 (6), 538-549 (1916).
Thomas, C. A. A method for rearing mushroom insects and mites. Entomol News. 40, 222-225 (1929).
Austin, M. D., Pitcher, R. S. A laboratory method for rearing Sciara and phorid flies. Entomol Mon Mag. 72, 12-15 (1936).
Butt, F. H., Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. Culture of Sciara. Culture methods for invertebrate animals. , 400-401 (1937).
Hudson, E. K. Regulation of greenhouse sciarid fly populations using Tetradonema plicans (Nematoda: Mermithoidea). J Invert Pathol. 23 (1), 85-91 (1974).
Wilkinson, J. D., Daughterty, D. M. Comparative development of Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae) under constant and variable temperatures. Ann Entomol Soc Am. 63 (4), 1079-1083 (1970).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Gerbi, S. A. Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism. J. Vis. Exp. (206), e66751, doi:10.3791/66751 (2024).