Enhancing Density Maps by removing the majority of particles in single particle cryyogenic electron microscopy final stacks(단일 입자 극저온 전자 현미경 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 향상)
Summary
Cryo-EM을 위한 고급 입자 선택 방법인 CryoSieve는 실제 데이터 세트에 적용하여 입증된 바와 같이 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 해상도를 향상시킵니다.
Abstract
지난 10년 동안 극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 단일 입자 분석(SPA) 분야의 기술 및 방법론의 발전으로 생물학적 거대분자의 고해상도 구조 검사 능력이 크게 향상되었습니다. 이러한 발전은 분자 통찰력의 새로운 시대를 열었으며, 지배적인 방법인 X선 결정학을 대체하고 생물학의 오랜 질문에 대한 답을 제공했습니다. Cryo-EM은 X선 결정학의 중요한 한계인 결정화에 의존하지 않기 때문에 다양한 품질의 입자를 캡처합니다. 결과적으로, 선택된 입자의 품질이 재구성된 밀도 맵의 해상도에 직접적인 영향을 미치기 때문에 입자의 선택이 매우 중요합니다. CryoSieve라고 하는 입자 선택을 위한 혁신적인 반복 접근 방식은 최종 스택의 입자 수를 효과적으로 줄여 재구성된 밀도 맵의 품질을 크게 향상시킵니다. 실험적 증거에 따르면 이 방법은 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거할 수 있어 밀도 맵의 품질이 눈에 띄게 향상됩니다. 이 문서에서는 이 접근 방식의 자세한 워크플로를 간략하게 설명하고 실제 데이터 세트에 적용하는 방법을 소개합니다.
Introduction
극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 단일 입자 분석(SPA)은 생물학적 거대분자의 고해상도 3차원 밀도 맵을 결정하는 지배적인 방법이 되었습니다. 분해능 혁명7이라고 불리는 일련의 기술 혁신 1,2,3,4,5,6 덕분에 Cryo-EM은 전례 없는 속도로 최대 원자 분해능으로 생물학적 거대분자의 구조를 결정할 수 있습니다. 이 돌파구는 분자 통찰력의 새로운 시대가 시작되었음을 의미하며, X선 결정학을 제치고 지배적인 기술로서 오랜 생물학적 질문에 답합니다.
Cryo-EM SPA는 생물학적 거대분자의 결정화가 필요하지 않다는 점에서 X선 결정학과 다릅니다. 대신, 표적 생물학적 거대분자를 포함하는 용액은 유리체 얼음에서 빠르게 동결됩니다. 그런 다음 전자빔으로 이미지화하여 일련의 현미경 사진을 생성하며, 결정화의 필요성을 우회합니다8. 그 후, 입자 선택 알고리즘을 사용하여 이러한 현미경 사진 4,9,10,11,12에서 개별 원시 입자를 추출합니다. Cryo-EM은 결정화에 의존하지 않기 때문에 추출된 입자가 주로 손상되거나 원치 않는 구조적 상태에 있는 것은 당연하며, 고분해능 밀도 맵을 얻기 위해 여러 차례의 입자 선택이 필요합니다. 따라서 Cryo-EM SPA 이미지 처리에서 입자 선택은 고해상도 밀도 맵을 얻는 데 매우 중요합니다13.
Cryo-EM SPA에서 표준 입자 선택 방법에는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 분류14가 포함됩니다. 2D 분류는 입자를 사전 정의된 수의 그룹으로 분류하여 각 등급에 대한 평균 이미지와 예상 2D 해상도를 생성합니다. 그런 다음 연구원은 이러한 클래스를 육안으로 검사하여 저해상도 그룹에서 입자를 제거하고 나머지 입자를 더 높은 해상도를 얻기 위한 재구성에 사용할 수 있습니다. 미세 조정 알고리즘을 사용하여 입자 포즈가 설정되면 연구원들은 입자를 여러 클래스로 클러스터링하는 3D 분류를 진행합니다. 이를 통해 각 등급에 대해 재구성된 밀도 맵을 육안으로 검사할 수 있으며, 원치 않는 형태와 같은 원치 않는 입자를 제외할 수 있습니다. 여러 차례의 분류를 거친 후, 상대적으로 고품질의 입자로 구성된 최종 스택이 얻어집니다. 이러한 최종 스택은 원자 또는 거의 원자 해상도 밀도 맵을 생성하는 데 중요한 역할을 합니다.
Zhu와 그녀의 동료들은 이러한 최종 스택15에서 추가 입자 선택이 수행될 수 있음을 입증했습니다. 입자 선택을 위한 혁신적인 반복 방법인 CryoSieve15를 적용하여 입자 수를 크게 줄여 최종 밀도 맵의 품질을 향상시킬 수 있습니다. NCC(Normalized Cross-Correlation) 방법16, AGC(Angular Graph Consistency) 방법17 및 Non-alignment Classification5과 같은 다른 입자 분류 기준 및 소프트웨어가 현재 이 분야에서 사용되고 있지만, 이 방법은 효율성 측면에서 이러한 알고리즘을 능가하는 것으로 나타났습니다.
이 연구에서는 전체 프로세스에 대한 자세한 가이드를 제시합니다. 사례 연구로, 이 새로운 방법을 최종 스택에 130,000개의 입자를 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 삼량체(EMPIAR 항목: 10097)18의 데이터 세트에 적용했습니다. 우리의 절차는 이 데이터 세트의 최종 스택에서 입자의 약 73.8%를 성공적으로 제거하여 재구성된 밀도 맵의 해상도를 4.11 Å에서 3.62 Å로 개선했습니다. 인플루엔자 헤마글루티닌 트라이머 외에도 여러 데이터 세트의 결과가 이전 간행물15에 제시되어 생체 분자의 다양한 해상도와 분자량을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cryo-EM은 생물학적 분자의 구조를 규명하기 위한 중추적인 기술입니다. 이 과정에서는 현미경을 통한 데이터 수집 후 현미경 사진에서 입자를 추출한 후 여러 단계로 분류하여 최종 스택을 컴파일하는 것이 필수적입니다. 일반적인 과제는 손상되거나 바람직하지 않게 정렬된 입자가 우세하다는 것이며, 이는 고해상도 밀도 맵을 얻기 위해 반복적인 입자 선택의 필요성을 강조합니다. 따라서 입자 선택은 고품질 밀도 맵을 달성하기 위한 Cryo-EM SPA에서 중요한 단계입니다. 현존하는 입자 선택 기법은 통계적 비기울기 검증 알고리즘(22), z-점수 기반 접근법(23) 및 각도 정확도 추정 방법(24)을 포함한다.
CryoSieve는 이러한 맥락에서 최종 스택에서 상당한 수의 외부 입자를 제거하는 데 능숙한 유용한 도구로 부상합니다. 이러한 감소는 재구성의 계산 효율성을 향상시킬 뿐만 아니라 프로세스를 간소화합니다. 이는 입자 선택을 위한 포괄적인 제품군을 제공하며, 입자 폐기 정도와 그에 따른 분리능 개선은 초기 데이터 품질과 데이터 처리에 사용되는 방법론에 크게 좌우됩니다.
이 원고에서는 인플루엔자 헤마글루티닌 트리머(EMPIAR 항목: 10097)의 실제 사례 데이터 세트를 사용하여 입자 선별의 완전한 워크플로우를 제시했습니다. 여기에서 다루고 논의하는 단계는 입자 체질 및 포즈 재추정으로 요약할 수 있습니다. 최종 3D 재구성 볼륨은 3.62 Å의 해상도를 달성했으며, 알파 나선의 곁사슬은 게시된 밀도 맵에 비해 후처리 볼륨에서 더 선명했습니다.
CryoSieve는 GitHub(https://github.com/mxhulab/cryosieve)에서 사용할 수 있는 오픈 소스 방법입니다. 자세한 자습서는 홈페이지에서도 찾을 수 있습니다. 사용자는 자습서에 따라 설치하고 사용할 수 있습니다. 또한 cryosieve-csrefine 및 cryosieve-csrhbfactor의 두 가지 모듈이 제공됩니다. cryosieve-csrefine 모듈은 CryoSPARC(보충 파일 5) 내에서 다양한 작업의 순차적 실행을 자동화하도록 특별히 제작되었습니다. 이러한 작업에는 입자 스택 가져오기 및 ab initio, 균질 미세 조정 또는 불균일 미세 조정 작업 수행이 포함됩니다. 반면, cryosieve-csrhbfactor 모듈은 cryosieve-csrefine(보충 파일 6)의 기능을 활용하여 Rosenthal-Henderson B-factor의 측정을 자동화하도록 설계되었습니다.
현재 이 방법의 적용은 단일 형태 시나리오로 제한되어 있습니다. 결과적으로, 입자가 여러 형태를 나타내는 경우에는 해당 기능이 제한됩니다. 사용자는 정제된 입자 선택에 사용하기 전에 먼저 3D 분류에 참여하여 서로 다른 형태의 입자를 분리하는 것이 좋습니다. 더욱이, 이 방법은 최종 스택에서 입자의 50% 이상을 걸러내는 데 능숙함을 보여주지만, 이러한 폐기된 입자의 기원과 재구성 품질에 대한 기여도가 미미한 근본적인 이유는 불분명합니다. 이러한 이해의 차이로 인해 이러한 제한 사항을 포괄적으로 다루고 잠재적으로 수정하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
입자 분류 또는 입자 체질에는 세 가지 가능한 기존 방법이 있습니다. 우선, cisTEM4는 3D 미세 조정 후 각 단일 입자 이미지에 대한 점수를 보고할 수 있습니다. 사용자는 cisTEM 점수를 사용하여 입자를 분류하여 입자를 버릴 수 있습니다. 각도 그래프 일관성(AGC) 접근법(17)은 또한 잘못 정렬된 입자를 버리는 방법이다. 또한, 비정렬 분류(non-alignment classification)5는 3D 분류를 사용하여 입자를 버리는 전통적인 방법이다. 우리는 이러한 방법으로 유지되는 입자의 품질을 CryoSieve와 비교한 결과 CryoSieve의 유지 입자가 더 높은 품질을 가지고 있음을 발견했습니다15. 여기에 제시된 방법은 다른 방법보다 성능이 훨씬 뛰어나며 동일한 해상도에서 가장 적은 수의 입자를 달성합니다.
결과에서 입증된 바와 같이 Cryo-EM 최종 스택에 있는 대부분의 입자는 밀도 맵 재구성에 기여하지 않습니다. 즉, 이미지 획득 중에 수집된 모든 입자 중에서 선택된 소수, 즉 가장 미세한 부분 집합만이 실제로 최종 재구성에 기여합니다. 결과적으로, 수집된 입자의 총 수에 대한 이 최종 하위 집합의 비율은 시료 품질을 평가하기 위한 정량적 지표 역할을 할 수 있습니다. 이 비율이 높을수록 샘플 품질이 좋아집니다. 구조 생물학자가 Cryo-EM에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하는 기술 발전에도 불구하고 시료 전처리는 여전히 워크플로우의 주요 병목 현상입니다. 따라서 과학자와 공학자들은 이 도전에 노력을 집중하고 있다25. 단일 입자 분석(SPA)에서 시료 전처리는 시료 최적화와 그리드 전처리의 두 가지 중요한 단계로 구성됩니다. 전자는 최적의 생화학적 상태를 유지하면서 표본을 정제하는 것과 관련이 있습니다. 후자는 그리드의 화학적 또는 플라즈마 처리, 시료 증착 및 유리화를 포함하여 현미경에서 분석하기 위해 시료를 준비하는 것을 수반합니다. 고분자 불안정성을 해결하기 위해 수많은 기술이 제안되었지만, 한 접근법이 다른 접근법에 비해 효능은 샘플의 특성에 따라 다릅니다25,26. 현재 그리드 준비 결과는 사용자의 전문 지식과 경험에 크게 영향을 받기 때문에 프로세스에 시간이 많이 걸리고 까다로울 수 있습니다27,28. 시료 및 그리드 준비에서 발생하는 수많은 변수는 연구자들이 현미경을 사용하여 분자 수준에서만 시료를 평가할 수 있기 때문에 인과 관계를 설정하는 데 어려움을 초래합니다. 그 결과, 서로 다른 시료 및 그리드 전처리 프로토콜의 비교를 통한 정량적 통계는 여전히 부족하며, 추세를 조사하고 시료 거동의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 체계적인 접근이 필요하다29.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Shenzhen Academy of Research and Translation(M.H.까지), Advanced Innovation Center for Structural Biology(M.H.까지), Beijing Frontier Research Center for Biological Structure(M.H.까지), National Key R&D Program of China(No.2021YFA1001300)(C.B.까지), National Natural Science Foundation of China(No.12271291)(C.B.까지)의 지원을 받았습니다. 및 중국 국립 자연 과학 재단 (No.12071244) (Z.S.).
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. Toronto, Canada | CryoSPARC (Cryo-EM Single Particle Ab-Initio Reconstruction and Classification) is a state of the art HPC software solution for complete processing of single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) data. CryoSPARC is useful for solving cryo-EM structures of membrane proteins, viruses, complexes, flexible molecules, small particles, phase plate data and negative stain data. | |
| EMPIAR-10097 Dataset | https://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcs | This dataset comprises single-particle cryo-EM data of the Influenza Hemagglutinin trimer, characterized by its highly preferred orientation, collected using a 40-degree tilted collection strategy. | |
| initial.mrc | https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097 | ||
| mask.mrc | https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097 | ||
| RELION | 4.0-beta-2 | RELION (REgularised LIkelihood OptimisatioN) is an open-source software for cryo-electron microscopy (cryo-EM) data processing, particularly for refining macromolecular structures. Utilizing a Bayesian approach, it excels in separating signal from noise, enabling high-resolution structure determination. RELION supports single-particle analysis, tomography, and sub-tomogram averaging, and has become widely used in structural biology due to its effectiveness and user-friendly interface. | |
| T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star | https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097 | Metadata file for the final stack of particles from EMPIAR-10097 |
Riferimenti
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., Mcmullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-em particles. elife. 2, 00461 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-em. Nat Meth. 10 (6), 584-590 (2013).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. Cis tem, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, e35383 (2018).
- Scheres, S. H. Relion: Implementation of a bayesian approach to cryo-em structure determination. J Str Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. Cryosparc: Algorithms for rapid unsupervised cryo-em structure determination. Nat Meth. 14 (3), 290-296 (2017).
- Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quart Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).
- Wagner, T., et al. Sphire-cryolo is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Comm Biol. 2 (1), 218 (2019).
- Bepler, T., et al. Positive-unlabeled convolutional neural networks for particle picking in cryo-electron micrographs. Nat Meth. 16 (11), 1153-1160 (2019).
- Wang, F., et al. Deeppicker: A deep learning approach for fully automated particle picking in cryo-em. J Str Biol. 195 (3), 325-336 (2016).
- Heimowitz, A., Andén, J., Singer, A. Apple picker: Automatic particle picking, a low-effort cryo-em framework. J Str Biol. 204 (2), 215-227 (2018).
- Glaeser, R. M. How good can single-particle cryo-em become? What remains before it approaches its physical limits. Ann Rev Biophys. 48, 45-61 (2019).
- Diiorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion. J Vis Exp. (179), e63387 (2022).
- Zhu, J., et al. A minority of final stacks yields superior amplitude in single-particle cryo-em. Nat Comm. 14 (1), 7822 (2023).
- Zhou, Y., Moscovich, A., Bendory, T., Bartesaghi, A. Unsupervised particle sorting for high-resolution single-particle cryo-em. Inv Probl. 36 (4), 044002 (2020).
- Méndez, J., Garduno, E., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. Identification of incorrectly oriented particles in cryo-em single particle analysis. J Str Biol. 213 (3), 107771 (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Meth. 14 (8), 793-796 (2017).
- Rosenthal, P. B., Henderson, R. Optimal determination of particle orientation, absolute hand, and contrast loss in single-particle electron cryomicroscopy. J Mol Biol. 333 (4), 721-745 (2003).
- Kaur, S., et al. Local computational methods to improve the interpretability and analysis of cryo-em maps. Nat Comm. 12 (1), 1240 (2021).
- Stagg, S. M., Noble, A. J., Spilman, M., Chapman, M. S. Reslog plots as an empirical metric of the quality of cryo-em reconstructions. J Str Biol. 185 (3), 418-426 (2014).
- Vargas, J., Otón, J., Marabini, R., Carazo, J. M., Sorzano, C. Particle alignment reliability in single particle electron cryomicroscopy: A general approach. Sci Rep. 6 (1), 21626 (2016).
- Vargas, J., et al. Particle quality assessment and sorting for automatic and semiautomatic particle-picking techniques. J Str Biol. 183 (3), 342-353 (2013).
- Vargas, J., Melero, R., Gomez-Blanco, J., Carazo, J. -. M., Sorzano, C. O. S. Quantitative analysis of 3d alignment quality: Its impact on soft-validation, particle pruning and homogeneity analysis. Sci Rep. 7 (1), 6307 (2017).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’sample preparation for single-particle cryo-em. J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Sec D: Str Biol. 74 (6), 560-571 (2018).
- Glaeser, R. M. How good can cryo-em become. Nat Meth. 13 (1), 28-32 (2016).
- Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50 (2018).
- Weissenberger, G., Henderikx, R. J., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em. Nat Meth. 18 (5), 463-471 (2021).
