일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay
Summary
이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.
Abstract
적응 면역 반응은 병원체와 이물질에 반응하여 혈액, 림프 및 조직을 통해 이동하는 T 세포의 능력에 의존합니다. T 세포 이동은 케모카인, 케모카인 수용체 및 접착 분자를 포함한 환경 및 국소 면역 세포의 많은 신호 입력의 조정이 필요한 복잡한 과정입니다. 또한 T 세포 운동성은 활성화 상태, 전사 환경, 접착 분자 발현 등을 변경할 수 있는 동적 주변 환경 단서의 영향을 받습니다. 생체 내에서는 겉으로 보기에 서로 얽혀 있는 것처럼 보이는 요인들의 복잡성으로 인해 T 세포 이동에 기여하는 개별 신호를 구별하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 매우 특정한 환경 조건에서 실시간으로 T 세포 이동을 평가하기 위해 T 세포 분리에서 컴퓨터 지원 분석에 이르기까지 일련의 방법을 제공합니다. 이러한 조건은 이동을 조절하는 메커니즘을 규명하고, T 세포 동역학에 대한 이해를 높이고, 동물 실험을 통해 얻기 어려운 강력한 기계론적 증거를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 이동에 영향을 미치는 분자 상호 작용에 대한 심층적인 이해는 개선된 치료법을 개발하는 데 중요합니다.
Introduction
T 세포는 적응형 항원 특이적 면역 반응의 주요 효과인자입니다. 집단 수준에서 T 세포는 이질적이며, 뚜렷한 특수 기능을 가진 세포 하위 집합으로 구성됩니다. 중요한 것은 CD8+ T 세포가 면역 체계의 주요 세포 용해 효과인자로, 감염되거나 기능 장애가 있는 세포를 직접 제거한다는 것입니다1.
성숙한 CD8+ T 세포는 조직에 상주하며 항원을 찾기 위해 혈액과 림프관을 순환합니다. 감염 중에는 T 세포에 혈액이나 조직에 항원이 제시되고 비장이나 가장 가까운 배수 림프절로 빠르게 배출되어 생산적인 면역 반응을 시작합니다. 어느 경우에나, T 세포는 활성화되고, 클론 확장을 겪으며, 림프계가 혈액 속으로 들어가도록 내버려 둔다. 이 과정에서 세포내 신호전달은 림프 귀환 수용체(lymphatic homing receptor)의 하향 조절과 조직 특이적 이동에 필수적인 수많은 인테그린 수용체(integrin receptor)와 케모카인 수용체(chemokine receptor)의 상향 조절을 부여한다2. 궁극적으로, T 세포가 감염 부위로 직접 이동하는 것은 인테그린(integrin)과 케모카인(chemokine) 신호전달을 포함하는 환경적 신호의 수렴에 의해 주도됩니다.
케모카인은 크게 두 가지로 분류할 수 있습니다: (1) 분화, 생존 및 기초 기능에 필수적인 항상성 신호와 (2) 화학주성에 필요한 CXCL9, CXCL10, CCL3와 같은 염증 신호. 일반적으로 케모카인은 인테그린 발현1을 활성화하는 것 외에도 화학주성(chemotaxis)으로 알려진 방향성 이동을 촉진하는 신호 구배를 생성합니다. 화학주성은 미세하게 조절되고 매우 민감하며, T 세포는 특정 방향이나 위치로 유도할 수 있는 구배의 작은 변화에 반응할 수 있습니다.
이러한 T 세포 관련 요인 외에도 이동은 세포외 기질(ECM) 조성 및 밀도에 의해서도 영향을 받습니다. ECM은 콜라겐과 프로테오글리칸을 포함한 단백질의 조밀한 네트워크로 구성되어 있으며, 이들은 T 세포의 접착 인테그린 수용체에 대한 골격을 제공합니다. 인테그린(Integrins)은 다양한 막관통 단백질군으로, 각 단백질은 고도로 전문화된 결합 도메인과 다운스트림 신호 효과를 가지고 있습니다. T 세포 표면에서 인테그린 수용체의 동적 발현은 변화하는 환경에 빠르게 적응할 수 있도록 합니다3. 중요한 것은 인테그린이 ECM과 세포 내 세포골격 액틴 네트워크를 연결하여 T 세포 이동에 필요한 추진력을 생성한다는 것입니다.
요약하면, 이동 패턴은 면역 세포 표현형 또는 환경 신호에 따라 달라집니다. 이러한 복잡한 생물학적 과정은 T 세포, 주변 세포 및 국소적으로 감염된 조직의 표면에서 사이토카인, 케모카인 및 인테그린의 발현에 의해 엄격하게 조절됩니다. 생체 내에서, 이러한 이동 메커니즘은 복잡할 수 있으며, 여러 가지 부가적 신호(additive signal)4에 의해 발생할 수 있다. 이러한 복잡성으로 인해 겉보기에 서로 맞물려 있는 것처럼 보이는 변수 간의 인과 관계를 설정하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 특정 케모카인 신호에 대한 반응 및 T 세포 인테그린과 ECM 결합 단백질 간의 상호 작용과 같은 T 세포 이동의 특정 측면을 연구하기 위한 몇 가지 시험관 내 접근 방식이 있습니다. 이 프로토콜은 2차원 공간에서의 체외 이동 분석과 지정된 T 세포 이동을 분석하기 위한 계산 분석 도구를 사용하여 쥐 CD8+ T 세포를 분리하고 활성화하는 방법을 다룹니다. 이러한 방법은 문헌에 기술된 일부 다른 세포 이동 분석법과 같이 정교한 재료나 장치를 필요로 하지 않기 때문에 사용자에게 유리합니다. 이러한 방법으로 생성된 세포 이동 데이터는 생체 내에서 정보에 입각한 추가 조사를 가능하게 하는 단순한 방식으로 면역 반응의 증거를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 내 수렴 신호의 생물학적 영향을 이해하는 것은 어렵고 해석하기도 쉽지 않습니다. 본 명세서에 제시된 프로토콜은 고도로 정의되고 생물학적으로 유의미한 조건에서의 T 세포 이동을 이해하기 위한 합리적인 방법을 제공한다. 이러한 조건은 연구자의 재량에 따라 지정할 수 있으며 다양한 T 세포 집단, 활성화 상태 및 세포 표현형의 요구에 맞게 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 또한…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 시간이 지남에 따라 이러한 프로토콜의 개발에 기여한 Kim Lab의 이전 및 현재 구성원에게 감사드립니다. 대표 데이터는 P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States 및 P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States에 의해 가능했습니다. 이 간행물은 Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award의 보조금 번호 T32 GM135134 덕분에 부분적으로 가능했습니다.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
Riferimenti
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).
- Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850 (2023).
- Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352 (2015).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
- Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
- Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231 (2021).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
- Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
- Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
- Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
- Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
- Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963 (2014).
- Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).
