Essai de migration in vitro en temps réel pour les lymphocytes T CD8+ murins primaires
Summary
Ce protocole fournit une méthode d’isolement primaire des lymphocytes T murins et de microscopie à intervalle de la migration des lymphocytes T dans des conditions environnementales spécifiques avec une analyse quantitative.
Abstract
La réponse immunitaire adaptative dépend de la capacité d’un lymphocyte T à migrer dans le sang, la lymphe et les tissus en réponse aux agents pathogènes et aux corps étrangers. La migration des lymphocytes T est un processus complexe qui nécessite la coordination de nombreux signaux provenant de l’environnement et des cellules immunitaires locales, y compris les chimiokines, les récepteurs de chimiokines et les molécules d’adhésion. De plus, la motilité des lymphocytes T est influencée par les signaux environnementaux dynamiques environnants, qui peuvent modifier l’état d’activation, le paysage transcriptionnel, l’expression des molécules d’adhésion, etc. In vivo, la complexité de ces facteurs apparemment entrelacés rend difficile la distinction des signaux individuels qui contribuent à la migration des lymphocytes T. Ce protocole fournit une série de méthodes allant de l’isolement des lymphocytes T à l’analyse assistée par ordinateur pour évaluer la migration des lymphocytes T en temps réel dans des conditions environnementales très spécifiques. Ces conditions peuvent aider à élucider les mécanismes qui régulent la migration, améliorant ainsi notre compréhension de la cinétique des lymphocytes T et fournissant des preuves mécanistes solides qui sont difficiles à obtenir par des expériences sur des animaux. Une compréhension plus approfondie des interactions moléculaires qui ont un impact sur la migration cellulaire est importante pour développer des thérapies améliorées.
Introduction
Les lymphocytes T sont les principaux effecteurs de la réponse immunitaire adaptative spécifique à l’antigène. Au niveau de la population, les lymphocytes T sont hétérogènes, composés de sous-ensembles cellulaires avec des fonctions spécialisées distinctes. Il est important de noter que les lymphocytes T CD8+ sont les principaux effecteurs cytolytiques du système immunitaire, qui éliminent directement les cellules infectées ou dysfonctionnelles1.
Les lymphocytes T CD8+ matures résident dans les tissus et circulent dans le sang et les lymphatiques à la recherche d’antigènes. Au cours de l’infection, les lymphocytes T sont présentés avec des antigènes dans le sang ou les tissus et s’écoulent rapidement vers la rate ou le ganglion lymphatique drainant le plus proche pour commencer une réponse immunitaire productive. Dans les deux cas, les lymphocytes T sont activés, subissent une expansion clonale et quittent le système lymphatique pour entrer dans le sang, s’ils ne s’y sont pas déjà produits. Au cours de ce processus, la signalisation intracellulaire confère la régulation négative des récepteurs de guidage lymphatique et la régulation positive de nombreux récepteurs d’intégrines et de chimiokines essentiels à la migration spécifique des tissus2. En fin de compte, la migration dirigée des lymphocytes T vers les sites d’infection est entraînée par des signaux environnementaux convergents qui incluent la signalisation de l’intégrine et de la chimiokine.
Les chimiokines peuvent être classées en deux classes principales : (1) les signaux homéostatiques, qui sont essentiels à la différenciation, à la survie et à la fonction basale, et (2) les signaux inflammatoires, tels que CXCL9, CXCL10 et CCL3, qui sont nécessaires à la chimiotaxie. Généralement, les chimiokines créent un gradient de signal qui entraîne une migration directionnelle, connue sous le nom de chimiotaxie, en plus d’activer l’expression de l’intégrine1. La chimiotaxie est finement régulée et très sensible, les lymphocytes T étant capables de répondre à de minuscules changements de gradient qui peuvent les conduire vers une direction ou un emplacement spécifique.
En plus de ces facteurs liés aux lymphocytes T, la migration est également affectée par la composition et la densité de la matrice extracellulaire (MEC). L’ECM est composée d’un réseau dense de protéines, y compris le collagène et les protéoglycanes, qui fournissent l’échafaudage pour les récepteurs adhésifs de l’intégrine sur les lymphocytes T. Les intégrines sont une famille diversifiée de protéines transmembranaires, chacune avec des domaines de liaison hautement spécialisés et des effets de signalisation en aval. L’expression dynamique des récepteurs de l’intégrine à la surface d’un lymphocyte T permet une adaptation rapide à leur environnement changeant3. Il est important de noter que les intégrines connectent l’ECM et les réseaux d’actine cytosquelettique intracellulaires qui travaillent ensemble pour générer la force propulsive nécessaire au mouvement des lymphocytes T.
En résumé, les schémas de migration varient en fonction du phénotype des cellules immunitaires ou des signaux environnementaux. Ces processus biologiques complexes sont étroitement régulés par l’expression de cytokines, de chimiokines et d’intégrines à la surface des lymphocytes T, des cellules environnantes et des tissus locaux infectés. In vivo, ces mécanismes migratoires peuvent être complexes et peuvent résulter de plusieurs signaux additifs4. En raison de cette complexité, il peut être impossible d’établir une relation de cause à effet entre des variables apparemment imbriquées. Pour surmonter cela, il existe plusieurs approches in vitro pour étudier des aspects spécifiques de la migration des lymphocytes T, tels que la réponse à des signaux spécifiques de chimiokines et l’interaction entre les intégrines des lymphocytes T et les protéines de liaison ECM. Ce protocole aborde les méthodes d’isolement et d’activation des lymphocytes T CD8+ murins, avec des tests de migration in vitro dans l’espace bidimensionnel et des outils d’analyse computationnelle pour analyser la migration des lymphocytes T spécifiés. Ces méthodes sont avantageuses pour l’utilisateur car elles ne nécessitent pas de matériaux ou de dispositifs sophistiqués, comme c’est le cas pour certains autres tests de migration cellulaire décrits dans la littérature. Les données de migration cellulaire générées à l’aide de ces méthodes peuvent fournir des preuves de réponses immunitaires d’une manière simpliste, ce qui permet une enquête plus approfondie et éclairée in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendre l’impact biologique des signaux convergents in vivo est difficile et difficile à interpréter. Les protocoles présentés ici fournissent une méthode raisonnable pour comprendre la migration des lymphocytes T dans des conditions hautement définies et biologiquement pertinentes. Ces conditions peuvent être spécifiées à la discrétion de l’investigateur, et les protocoles peuvent être modifiés pour répondre aux besoins de diverses populations de lymphocytes T, à l’état d’activation e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres précédents et actuels du Kim Lab qui ont contribué à l’élaboration de ces protocoles au fil du temps. Des données représentatives ont été rendues possibles par P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/États-Unis et P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/États-Unis. Cette publication a été rendue possible en partie grâce à la subvention numéro T32 GM135134 à la bourse du Service national de recherche Ruth L. Kirschstein.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
Riferimenti
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