¹³C_6-Marcação de glicose associada a LC-MS: Identificação de órgãos primários de plantas na síntese de metabólitos secundários

As vias biossintéticas dos metabólitos secundários nas plantas são intrincadas e diversas, envolvendo órgãos de acumulação altamente específicos e diversos¹. Atualmente, os locais de síntese específicos e os órgãos responsáveis pelos metabólitos secundários em muitas plantas medicinais não estão bem definidos. Essa ambigüidade representa um obstáculo significativo para o avanço estratégico e a implementação de métodos de cultivo projetados para otimizar o rendimento e a qualidade dos materiais medicinais.

Técnicas de biologia molecular, bioquímica e marcação de isótopos são amplamente empregadas para desvendar as vias de síntese e locais de metabólitos secundários em plantas medicinais 2,3,4,5, e cada uma dessas metodologias exibe pontos fortes e limitações únicas, como diferenças de eficiência e precisão. As abordagens de biologia molecular, por exemplo, oferecem alta precisão na identificação dos locais dentro das vias biossintéticas, mas são notavelmente demoradas. Sua utilidade é ainda mais restrita para espécies sem sequências genômicas disponíveis publicamente, tornando essas técnicas menos viáveis para esses casos⁶. Em contraste, as técnicas de marcação de isótopos, empregando razões isotópicas como ³C / ¹²C, ²H / ¹H e ¹⁸O / ¹⁶O, fornecem um meio rápido e acessível para investigar os mecanismos de síntese, transporte e armazenamento de metabólitos secundários ^7,8. Eles podem revelar a distribuição espacial de compostos orgânicos e isótopos estáveis nas folhas, permitindo assim a reconstrução das condições ambientais experimentadas pelas folhas ao longo de seu ciclo de vida⁹. Além disso, a aplicação de marcadores isotópicos externos, como ¹³C_6-Glicose ¹⁰ e ¹³C 6-Fenilalanina¹¹, permite a geração de metabólitos secundários marcados com carbono, melhorando nossa compreensão de sua produção e função.

As técnicas tradicionais de marcação de isótopos de carbono encontram desafios para identificar os órgãos específicos responsáveis pela síntese de metabólitos secundários devido à natureza altamente específica de suas vias biossintéticas e mecanismos de transporte. A cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) ganhou destaque como um instrumento analítico fundamental nessa área, oferecendo um método robusto para rastrear isótopos exógenos na síntese química de medicamentos e investigar processos in vivo, como absorção, distribuição, metabolismo e excreção¹². A sensibilidade, franqueza e confiabilidade superiores do LC-MS o tornam a escolha ideal para monitorar a produção de metabólitos secundários em plantas¹³. Nos últimos tempos, a LC-MS tornou-se cada vez mais favorecida por sua aplicação em técnicas externas de marcação de isótopos, o que permite a avaliação da eficiência da marcação em diferentes amostras. Essa metodologia fornece informações críticas sobre os órgãos primários envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais, servindo como um complemento inestimável aos métodos biológicos para identificar os órgãos de síntese desses compostos^14,15. Consequentemente, essa abordagem não apenas facilita a comparação das eficiências de marcação entre vários espécimes, mas também lança luz sobre os principais órgãos implicados na geração de metabólitos secundários de plantas, melhorando assim nossa compreensão de sua biossíntese.

Introduzimos um novo método que combina a marcação de isótopos de carbono com a detecção de LC-MS para identificar os órgãos primários responsáveis pela síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais. A saponina parisiense (PS) tem uma variedade de atividades farmacológicas, como anticâncer, imunomodulação e anti-inflamatória¹⁶, e o PPY está em demanda crescente¹⁷. Portanto, usamos mudas de PPY como sujeitos de pesquisa e deciframos que as folhas são o órgão primário para sintetizar a saponina Paris VII (PS VII) (Figura 1B) usando a marcação ^{de 13}C_6-glicose associada ao método LC-MS. Nossa abordagem incluiu quatro tratamentos diferentes envolvendo ¹³C_6-Glucose alimentando feixes foliares, rizomáticos e vasculares do caule, bem como um controle não alimentar. A escolha da ¹³C_6-Glicose é estratégica, pois é rapidamente metabolizada em acetil coenzima A via respiração, o que facilita a síntese de PS. Empregando a abundância natural de ¹³C, utilizamos um sistema de espectrômetro de massa de razão isotópica estável por cromatografia gasosa (GC-IRMS) para avaliar as razões ^{de 13}C / ¹²C em vários órgãos da planta e para analisar as razões de pico de íons isotópicos em moléculas de PS VII e saponinas Paris II (PS II) (Figura 1B). Nossa metodologia, que aproveita ¹³precursores de metabólitos secundários de plantas marcados com C e técnicas de espectrometria de massa de ponta, oferece uma alternativa mais simples e precisa aos métodos convencionais de marcação de isótopos de carbono. Essa nova abordagem não apenas aprofunda nossa compreensão dos órgãos envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais, mas também estabelece uma base sólida para futuras explorações nas vias biossintéticas desses compostos.