¹³C 6-Glukosemarkierung im Zusammenhang mit LC-MS: Identifizierung pflanzlicher Primärorgane bei der Synthese von Sekundärmetaboliten

Die Biosynthesewege von Sekundärmetaboliten in Pflanzen sind kompliziert und vielfältig und umfassen hochspezifische und vielfältige Akkumulationsorgane¹. Gegenwärtig sind die spezifischen Synthesestellen und verantwortlichen Organe für Sekundärmetaboliten in vielen Heilpflanzen nicht genau definiert. Diese Unklarheit stellt ein erhebliches Hindernis für die strategische Weiterentwicklung und Umsetzung von Anbaumethoden dar, die sowohl die Ausbeute als auch die Qualität von Arzneimitteln optimieren sollen.

Molekularbiologische, biochemische und Isotopenmarkierungstechniken werden ausgiebig eingesetzt, um die Synthesewege und -stellen von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen^zu entschlüsseln 2,3,4,5, und jede dieser Methoden weist einzigartige Stärken und Grenzen auf, wie z. B. Unterschiede in der Effizienz und Genauigkeit. Molekularbiologische Ansätze bieten beispielsweise eine hohe Präzision bei der Lokalisierung der Stellen innerhalb der Biosynthesewege, sind aber besonders zeitintensiv. Ihr Nutzen ist für Arten ohne öffentlich zugängliche Genomsequenzen weiter eingeschränkt, so dass diese Techniken in solchen Fällen weniger brauchbar sind⁶. Im Gegensatz dazu bieten Isotopenmarkierungstechniken unter Verwendung von Isotopenverhältnissen wie ³C/¹²C, ²H/¹H und ¹⁸O/¹⁶O ein schnelles und zugängliches Mittel zur Untersuchung der Synthese-, Transport- und Speichermechanismen von Sekundärmetaboliten ^7,8. Sie können die räumliche Verteilung von organischen Verbindungen und stabilen Isotopen in den Blättern aufdecken und ermöglichen so die Rekonstruktion der Umweltbedingungen, denen die Blätter während ihres gesamten Lebenszyklus ausgesetzt sind⁹. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung externer Isotopenmarkierungen wie ¹³_C6-Glucose ¹⁰ und ¹³C 6-Phenylalanin¹¹ die Erzeugung von kohlenstoffmarkierten Sekundärmetaboliten, wodurch unser Verständnis ihrer Produktion und Funktion verbessert wird.

Herkömmliche Techniken zur Markierung von Kohlenstoffisotopen stoßen aufgrund der hohen Speziesspezifität ihrer Biosynthesewege und Transportmechanismen auf Herausforderungen bei der Bestimmung der spezifischen Organe, die für die Synthese von Sekundärmetaboliten verantwortlich sind. Die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) hat sich in diesem Bereich zu einem wichtigen analytischen Instrument entwickelt, das eine robuste Methode zur Verfolgung exogener Isotope in der chemischen Synthese von Arzneimitteln und zur Untersuchung von In-vivo-Prozessen wie Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung bietet¹². Die überlegene Sensitivität, Einfachheit und Zuverlässigkeit der LC-MS machen sie zur idealen Wahl für die Überwachung der Produktion von Sekundärmetaboliten in Pflanzen¹³. In jüngster Zeit ist LC-MS zunehmend für ihre Anwendung in externen Isotopenmarkierungstechniken beliebt geworden, die die Bewertung der Markierungseffizienz über verschiedene Proben hinweg ermöglichen. Diese Methodik bietet wichtige Einblicke in die Primärorgane, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind, und stellt eine unschätzbare Ergänzung zu biologischen Methoden zur Identifizierung der Syntheseorgane dieser Verbindungen dar^14,15. Folglich erleichtert dieser Ansatz nicht nur den Vergleich der Markierungseffizienz zwischen verschiedenen Proben, sondern gibt auch Aufschluss über die Schlüsselorgane, die an der Bildung von pflanzlichen Sekundärmetaboliten beteiligt sind, und verbessert so unser Verständnis ihrer Biosynthese.

Wir haben eine neuartige Methode eingeführt, die die Kohlenstoffisotopenmarkierung mit der LC-MS-Detektion kombiniert, um die primären Organe zu identifizieren, die für die Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen verantwortlich sind. Pariser Saponin (PS) hat eine Vielzahl von pharmakologischen Aktivitäten wie Krebsbekämpfung, Immunmodulation und entzündungshemmende^{Wirkung 16}, und PPY ist zunehmend gefragt¹⁷. Daher haben wir PPY-Sämlinge als Forschungsobjekte verwendet und entschlüsselt, dass Blätter das primäre Organ für die Synthese des Pariser Saponins VII (PS VII) sind (Abbildung 1B), indem wir die ¹³C 6-Glukose-Markierung verwenden, die mit der LC-MS-Methode assoziiert ist. Unser Ansatz umfasste vier verschiedene Behandlungen, bei denen ¹³C_6-Glukose an Blatt-, Rhizom- und Stammgefäßbündel gefüttert wurde, sowie eine Kontrolle ohne Fütterung. Die Wahl von ¹³C_6-Glucose ist strategisch, da es über die Atmung schnell zu Acetyl-Coenzym A metabolisiert wird, das dann die PS-Synthese erleichtert. Unter Ausnutzung der natürlichen Häufigkeit von ¹³C verwendeten wir ein Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-IRMS), um die ¹³C/¹²C-Verhältnisse in verschiedenen Pflanzenorganen zu bewerten und die Isotopen-Ionen-Peak-Verhältnisse in PS VII- und Pariser Saponinen II (PS II) (Abbildung 1B) Molekülen zu analysieren. Unsere Methodik, die ¹³C-markierte pflanzliche Sekundärmetaboliten-Vorläufer und modernste Massenspektrometrietechniken nutzt, bietet eine einfachere und genauere Alternative zu herkömmlichen Methoden zur Markierung von Kohlenstoffisotopen. Dieser neuartige Ansatz vertieft nicht nur unser Verständnis der Organe, die an der Sekundärmetabolitensynthese in Heilpflanzen beteiligt sind, sondern legt auch eine solide Grundlage für zukünftige Erkundungen der Biosynthesewege dieser Verbindungen.