Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (<i>Arachis</i> spp.) Seeds

Victor S Sobolev; Renee S Arias; Alicia N Massa; Travis E Walk; Valerie A Orner; Marshall C Lamb

doi:10.3791/66574

JoVE Journal > Biochemistry

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Biochimica

Zerstörungsfreie SPE-UPLC-basierte Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnüssen (Arachis spp.) Samen

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66574

Victor S Sobolev, Renee S Arias, Alicia N Massa, Travis E Walk, Valerie A Orner, Marshall C Lamb

¹National Peanut Research Laboratory, Agricultural Research Service,U.S. Department of Agriculture

Summary

Wir demonstrieren eine Methode mit mittlerem Durchsatz zur Quantifizierung von Aflatoxinen und Stilbenoid-Phytoalexinen in einzelnen Erdnusssamen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Diese Methode wurde speziell für die Analyse von wilden Arachis-Arten entwickelt, die von der aflaoxigenen Aspergillus-Art befallen sind.

Abstract

Aflatoxine sind stark krebserregende Sekundärmetaboliten einiger Pilzarten, insbesondere von Aspergillus flavus. Aflatoxine kontaminieren häufig wirtschaftlich wichtige landwirtschaftliche Rohstoffe, einschließlich Erdnüsse, und stellen ein hohes Risiko für die Gesundheit von Mensch und Tier dar. Aufgrund der schmalen genetischen Basis zeigen Erdnusssorten eine begrenzte Resistenz gegen pilzliche Krankheitserreger. Daher wurden zahlreiche wilde Erdnussarten mit Toleranz gegenüber Aspergillus von Wissenschaftlern als Quellen für Krankheitsresistenz in Betracht gezogen.

Die Untersuchung des pflanzlichen Keimplasmas auf Resistenz gegen Aflatoxine ist schwierig, da die Aflatoxinakkumulation keiner Normalverteilung folgt, was die Analyse von Tausenden von einzelnen Erdnusssamen erforderlich macht. Ausreichend hydratisierte Erdnusssamen (Arachis spp.) sind, wenn sie von Aspergillus-Arten befallen sind, in der Lage, biologisch aktive Stilbene (Stilbenoide) zu produzieren, die als defensive Phytoalexine gelten. Erdnussstilbene hemmen die Pilzentwicklung und die Aflatoxinproduktion. Daher ist es wichtig, die gleichen Samen auf Erdnuss-Stilbenoide zu analysieren, um die Art der Samenresistenz/-anfälligkeit für die Aspergillus-Invasion zu erklären. Keine der veröffentlichten Methoden bietet Einzelsamenanalysen für Aflatoxine und/oder Stilben-Phytoalexine.

Wir haben versucht, die Nachfrage nach einer solchen Methode zu erfüllen, die umweltfreundlich ist, kostengünstige Verbrauchsmaterialien verwendet und sensibel und selektiv ist. Darüber hinaus ist die Methode zerstörungsfrei, da nur die Hälfte des Samens verwendet wird und die andere Hälfte, die die Embryonalachse enthält, intakt bleibt. Eine solche Technik ermöglicht die Keimung und das Wachstum der Erdnusspflanze bis zur vollen Reife aus demselben Samen, der für die Aflatoxin- und Stilbenoidanalyse verwendet wird. Der integrierte Teil dieser Methode, das manuelle Anfechten der Samen mit Aspergillus, ist ein limitierender Schritt, der im Vergleich zu anderen Schritten der Methode mehr Zeit und Arbeit erfordert. Die Methode wurde für die Erforschung von wildem Arachis-Keimplasma verwendet, um Spezies zu identifizieren, die gegen Aspergillus resistent sind, und um neue Quellen für genetische Resistenz gegen diesen Pilzerreger zu bestimmen und zu charakterisieren.

Introduction

Erdnuss (Arachis hypogaea L.) ist eine der wichtigsten Nahrungspflanzen der Welt. Er wird in mehr als 100 Ländern angebaut und hat eine Gesamtproduktion von mehr als 45 Millionen Tonnen¹. Landwirtschaftliche Rohstoffe wie Erdnüsse, Mais und Baumwollsamen werden oft von Aspergillus-Arten befallen, bodenbürtigen Pilzen, die Aflatoxine produzieren². Diese Rohstoffe sind besonders anfällig für eine Aflatoxinkontamination vor der Ernte, wenn die Umweltbedingungen durch hohe Temperaturen und Trockenheit gekennzeichnet sind. Aflatoxine gehören zu den stärksten bekannten Karzinogenen³. Sie kontaminieren ein Viertel der landwirtschaftlichen Rohstoffe der Welt⁴ , so dass etwa die Hälfte der Weltbevölkerung chronisch Aflatoxinen ausgesetzt ist⁵. Aufgrund ihrer hohen Karzinogenität und Toxizität wird das Vorhandensein von Aflatoxinen in Lebensmitteln in den meisten Ländern der Welt auf die niedrigsten praktisch akzeptablen Grenzwerte reguliert⁶.

Die Europäische Union (EU) hat einen Höchstgehalt von 2 ng/g für Aflatoxin B₁ und 4 ng/g für Gesamtaflatoxine (B₁, B₂, G₁ und G₂) in Lebensmitteln festgelegt⁷. Diese niedrigen Grenzwerte setzen die Landwirtschaft und die Lebensmittelindustrie, die mit Aflatoxinen kontaminierte Rohstoffe verarbeitet, unter erheblichen Druck. Die Aflatoxinüberwachung und die Wiederaufbereitung kontaminierter Erdnüsse kann als passive und kostspielige Strategie angesehen werden, um zu verhindern, dass Aflatoxine in die Nahrungskette gelangen. Aus diesem Grund erleiden alle wichtigen Segmente der Erdnussindustrie enorme Gewinnverluste aufgrund der Aflatoxinkontamination der aktuellen Erdnusssorten, die oft eine begrenzte Resistenz gegen Pilzkrankheiten aufweisen. Ein prospektiver Ansatz zur Lösung des Aflatoxinproblems besteht darin, pilzresistente Erdnusssorten durch Genintrogression zu erhalten, d.h. die Übertragung genetischer Informationen von resistenten wilden Erdnussarten auf Elitesorten. In den letzten Jahren ^8,9 wurden wilde Erdnussarten als Quellen für genetische Krankheitsresistenz in erheblichem Umfang in Betracht gezogen, da die schmale genetische Basis der kultivierten Erdnüsse der Erdnusspflanze nicht mehr das erforderliche Maß an Resistenzmerkmalen bieten kann^10,11. Eine erfolgreiche Introgression von wilden Erdnussarten erfordert die Analyse von Tausenden von einzelnen kleinen und seltenen Samen (Abbildung 1A) ¹².

Abbildung 1: Flussdiagramm der Einzelsamenanalyse. (A) Vergleichende Größe verschiedener markttypischer Erdnusssorten im Vergleich zu wilden Arachis spp. (1) Virginia; (2) Läufer; (3) Spanisch; (4) wilde Arachis spp. (B) wilde Arachis spp. (Tafel A, Samen 4) in drei Abschnitte geschnitten, (5) halber Samen mit embryonaler Achse; dieser Teil des Samens wird verwendet, um eine Pflanze zu züchten (E). (C) Die Teile (6) und (7) werden mit einem Bohrer gebohrt und (D) mit Pilzsporen beimpft. Nach einer Inkubation von 72 Stunden bei 30 °C wird einer der Samenteile (6) oder (7) für Aflatoxin- und Phytoalexinanalysen und ein anderer für die RNA/Transkriptom-Sequenzierung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Resistenz von Erdnüssen gegen pilzliche Krankheitserreger ist stark mit Phytoalexinen^assoziiert 13,14,15,16,17. Erdnuss-Phytoalexine werden durch antimikrobielle Stilbenoide repräsentiert, die biosynthetisiert und in Pflanzengeweben akkumuliert werden, nachdem sie exogenen Reizen, insbesondere der Pilzinvasion, ausgesetzt sind 16,17,18. Die schnelle Akkumulation ausreichender Konzentrationen von Phytoalexinen am Ort der Pilzinvasion hemmt das Pilzwachstum und ist entscheidend für die Pflanzenabwehr 19,20,21. Der Erreger hört auf zu wachsen, wenn sich Phytoalexine zu hemmenden Konzentrationen anreichern^16,22. Die Rolle von Stilbenoiden als Abwehrstoffe gegen aflatoxinische Pilze in Erdnüssen wurde vor über 30 Jahren in Feldversuchen untersucht¹³. Diese Experimente stützten eindeutig die Hypothese, dass Erdnuss-Stilbenoide ein entscheidender Resistenzfaktor für die Aflatoxinkontamination vor der Ernte sind. Diese Beweise beruhen auf der Tatsache, dass Stilbene auf natürliche Weise in feldgeschädigten Erdnüssen produziert werden; Stilbene zeigen eine bemerkenswerte biologische Aktivität gegen aflatoxinische Pilze; Und eine Aflatoxinkontamination in Samen wurde erst nachgewiesen, als Erdnüsse aufgrund dürrebedingter Samendehydrierung die Fähigkeit zur Phytoalexinsynthese verloren. Eine weitere Reihe von Feldexperimenten bestätigte den Zusammenhang zwischen der Phytoalexinproduktion und der Resistenz des Erdnussgenotyps gegenüber landwirtschaftlich wichtigen Erdnusskrankheiten¹⁷.

Ein besseres Verständnis des natürlichen Phytoalexin-basierten Mechanismus der Erdnussresistenz gegen Pilzinvasion ist eine vielversprechende Strategie zur Kontrolle der Aflatoxinkontamination^15,17.Daher ist es wichtig, zusätzlich zu den Aflatoxin-Analysen die gleichen Samen quantitativ auf Phytoalexine zu analysieren. Dieser Mechanismus der Resistenz ist zwar noch nicht vollständig erforscht und verstanden, aber dennoch entscheidend für die Züchtung und genetische Veränderung von Erdnusspflanzen für neue pilzresistente Sorten²³. Trotz der Existenz verschiedener analytischer Verfahren zur Aflatoxinbestimmung in verschiedenen Rohstoffen besteht nach wie vor ein Bedarf an einfachen Methoden für die spezifische Forschung, insbesondere wenn die traditionellen Methoden den analytischen und kostengünstigen Anforderungen nicht genügen. Die modernsten Reinigungsmethoden, die von der Erdnussindustrie, der Landwirtschaft und privaten Labors verwendet werden, sind Antikörper-basierte²⁴– und Immunoassay-25^-, ²⁶^– und ^27-Geräte. Sie sind selektiv und empfindlich, aber wesentlich teurer als Minisäulen, die mit herkömmlichen Adsorbentien gefüllt sind. Außerdem sei keine dieser Methoden für die Analyse von Proben mit einem Gewicht von wenigen Milligrammen konzipiert worden. Basierend auf unseren früheren Forschungen zur analytischen Verwendung von mit Magnesium-Kieselgel (Florisil) gefüllten Minisäulen²⁸ haben wir dieses Verfahren modifiziert, um den Anforderungen laufender und zukünftiger Vorzucht- und Zuchtprogramme gerecht zu werden.

Ziel dieser Arbeit war es, eine zerstörungsfreie, umweltfreundliche Methode mit mittlerem Durchsatz zur quantitativen Bestimmung von Aflatoxinen und Phytoalexinen in einzelnen Erdnusssamen zu entwickeln. Eine solche Methode wurde entwickelt. Die Vorteile gegenüber veröffentlichten Methoden sind eine höhere Sensitivität, die Möglichkeit, Aflatoxine und Phytoalexine in einem einzigen Samenextrakt zu analysieren, das Fehlen des Wiegens von Proben und niedrigere Kosten dank kleinerer Mengen an Verbrauchsmaterialien. Das Flussdiagramm der integrierten Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Die genetischen Analysen und andere Schritte werden in diesem Text erwähnt und in der Abbildung gezeigt, um die Bedeutung der vorgeschlagenen Methode und ihre Integration in das gesamte Verfahren zu verdeutlichen.

Protocol

1. Vorbereitung der Samen für die Pilzbefall Inkubieren Sie den aflatoxigenen Aspergillus flavus NRRL 3357 auf einer Schräge aus Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) in einem Reagenzglas für 6 Tage bei 30 °C. Entnehmen Sie Pilzsporen aus dem Reagenzglas mit 10 ml Wasser mit Tween 20 (100 μl Tween in 1 l destilliertem sterilem Wasser), filtrieren Sie durch Glaswolle, die in einen Trichter gegeben wird, und zählen Sie die Sporen mit einem Hämozytometer, das sich auf die Bedienungsanleitung bezieht. Verdünnen Sie die Sporensuspension mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 1.000 Sporen/μl. Bestätigen Sie die Konzentration mit einem Hämozytometer.HINWEIS: Bereiten Sie die Sporensuspension frühestens 2 Stunden vor den anspruchsvollen Experimenten vor. Die Erdnussschoten vorsichtig aufbrechen und die Schalen entfernen. Legen Sie die Samen so in ein steriles Becherglas, dass das Volumen der Samen 1/5 des Bechervolumens nicht überschreitet, fügen Sie 0,05 % Wasserstoffperoxidlösung zu etwa 70 % des Bechervolumens hinzu und lassen Sie die Samen 3 Stunden lang Wasser aufnehmen. Dezitieren Sie die Wasserstoffperoxidlösung von den Samen und geben Sie etwa die 3-fache Menge an 80% Ethanol-Wasser-Gemisch (v/v) in das Becherglas, um die Samen zu bedecken. 1 Minute ziehen lassen und dann die Samen 2x mit der gleichen Menge sterilem destilliertem Wasser abspülen. Geben Sie das 5-fache Volumen von 3 % Wasserstoffperoxid in das Becherglas mit den ethanolsterilisierten Samen und lassen Sie es 5 Minuten stehen, dann dekantieren Sie die Flüssigkeit und spülen Sie die Samen zweimal mit gleichen Mengen sterilem Wasser ab (Abbildung 2A). Abbildung 2: Vorbereitung von Erdnusssamen für die Inokulation, Inkubation und Extraktion von Aflatoxin- und Phytoalexinfraktionen. (A) Sterilisieren von getränkten Samen mit 3 % Wasserstoffperoxid; (B) Entfernen der Testa (Haut) von Samen; (C) Abschneiden des embryonalen Achsenteils; (D,E) Bohren eines Hohlraums in einem halben Keimblatt mit einem Bohrer; (F) Platzieren von gedrillten Teilen von Samen auf Agar; (G) Auftragen von Pilzsporen in den gebohrten Hohlraum. (H) Petrischale mit Samen nach der Inkubation; I) Einbringen von inkubierten Einzelsamen (Foto von Kontrollproben) in verstärkte Perlröhrchen; (J) Zugabe eines abgemessenen Volumens des Extraktionslösungsmittels; (K) Pulverisieren von Proben in einem Bead-Ruptor; (L) Zentrifugation der pulverisierten Gülle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Legen Sie die Samen auf ein steriles Papiertuch, entfernen Sie die Samentesta mit einer Pinzette und schneiden Sie mit einem Skalpell etwa 1/3 des Samens mit der Embryonalachse ab (Abbildung 2B,C). Entsorgen Sie diesen Teil des Samens oder verwenden Sie ihn, um eine Pflanze in einem Reagenzglas mit Wachstumsmedium zu züchten (Abbildung 1B,E). Teilen Sie den restlichen Teil des Samens in zwei Keimblätter, legen Sie sie in eine Petrischale, decken Sie die Samenteile mit feuchtem sterilem Filterpapier ab, setzen Sie den Deckel wieder auf, um eine Austrocknung zu vermeiden, und fahren Sie sofort mit dem Impfschritt fort. Bereiten Sie vor der Durchführung der anspruchsvollen Experimente eine ausreichende Anzahl von Petrischalen mit Keiminkubationsmedium vor, indem Sie 26 mL 1,5% sterilen Agar in Wasser in die 100 x 15 mm großen Schalen gießen und über Nacht erstarren lassen. In der Mitte der Außenseite jedes verbleibenden Keimblattes einen 1,5 bis 2 mm tiefen Hohlraum bohren, indem Sie das Saatgut manuell mit einem sterilen, scharfen Bohrer mit einem Durchmesser von 1,6 bis 2,34 mm bohren. Es dauert ~2-5 s, um einen Hohlraum herzustellen (Abbildung 2D,E). Legen Sie 4 bis 6 “gebohrte” Stücke der Samen in eine Petrischale mit Agar und geben Sie 2 μL der 1.000 Sporen/μl Suspension mit einer 10 μl Pipette in den gebohrten Hohlraum jedes halben Keimblattstücks. Anstelle der Sporensuspension steriles Wasser auf die Kontrollsamen auftragen (Abbildung 2F,G). Alle Petrischalen mit Deckeln abdecken und bei 30 °C ohne Licht 72 h inkubieren. 2. Probenahme und Vorbereitung der inkubierten Samenstücke für die Aflatoxin- und Phytoalexin-Analyse Sammeln Sie Samenstücke nach 72 Stunden, indem Sie sie mit einer Pinzette aus dem Agar entfernen und in beschriftete 7-ml-Kügelchen mit 13 Zirkoniumkeramikkügelchen (12 mit einem Durchmesser von 2,8 mm und 1 mit einem Durchmesser von 6,5 mm) legen (Abbildung 2H,I).HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Fläschchen, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden, in einen -80 °C-Gefrierschrank gestellt und bis zu 2 Monate aufbewahrt werden, bevor sie weiterverarbeitet werden. Phytoalexine und Aflatoxine werden im selben Samenextrakt bestimmt. Für die Extraktion werden je nach sichtbarer Samengröße (klein, mittel oder groß) 2 oder 4 mL eines genau abgemessenen Methanol-Wasser-Gemisches (90:10, v/v) in die Bead-Vials gegeben und 45 s lang mit 5,5 m/sec pulverisiert. Die Fläschchen mit den pulverisierten Samen in eine Zentrifuge geben und 3 Minuten lang bei 1.860 × g zentrifugieren (Abbildung 2J – L).HINWEIS: Die folgendenwichtigen 17,22 Stilbenoidderivate werden bestimmt (alle in trans-Konfiguration): Resveratrol, Arachidin-1, Arachidin-2, Arachidin-3, 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilben (IPD) und SB-1. Für Aflatoxinanalysen ist vor der Durchführung der anspruchsvollen Experimente eine ausreichende Anzahl von Aufreinigungssäulen wie folgt vorzubereiten. Legen Sie eine passende poröse (20 μL) Polyethylenfritte mit Hilfe einesim 90 °-Winkel geschnittenen Glasstabes in eine 1,5 mL Polypropylen-Säule. Geben Sie 50 mg des Magnesium-Kieselgels (100-200 mesh) mit einer speziell angefertigten Schaufel in die Säule und verschließen Sie die Säule mit einer identischen Fritte, indem Sie sie mit einem Glasstab nach unten drücken (Abbildung 3A – E).HINWEIS: Diese Menge an Magnesium-Kieselgel nimmt ein Volumen von 75 μl ein und die Höhe der Adsorptionsschicht beträgt 3 mm. Abbildung 3: Vorbereitung der Reinigungskolonnen und Filter. (A,B) Einbringen einer porösen Fritte in das Fass; (C,D) Füllzylinder mit Magnesium-Kieselgel; (E) Verpacken des Adsorptionsmittels und Einbringen einer oberen porösen Fritte in das Fass. (F) Platzieren eines Glasfaserkreises mit einem Durchmesser von 11,5 mm auf einer Pasteur-Pipette. (G,H) Schieben Sie die Mitte des Kreises mit einem Kunststoff- oder Holzstab auf den Boden des Pasteur-Pipettenzylinders und verdichten Sie die Glasfaser fest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Bereiten Sie an dieser Stelle eine entsprechende Anzahl von benutzerdefinierten Filtern vor, wie in Abbildung 3F – H gezeigt. Für Aflatoxinanalysen messen Sie genau bis zu 0,5 ml Aliquot des Überstands (erhalten wie in Schritt 2.2 beschrieben), überführen Sie es in die speziell verpackte Minisäule und lassen Sie den Extrakt durch Schwerkraft in ein 4-ml-Glasfläschchen abtropfen. Übertragen Sie 1,0 ml Methanol-Wasser-Gemisch (90:10, v/v) in die Säule, um Verunreinigungen durch Schwerkraft in dasselbe 4-ml-Fläschchen auszuwaschen (Abbildung 4A). Abbildung 4: Reinigung von Samenextrakten und Vorbereitung für die UPLC-Analysen. (A) Gestell mit gepackten Säulen. (B) Verdampfen des Lösungsmittels mit N2 -Gas aus sechs 4-ml-Fläschchen mit gereinigtem Extrakt, der aus Reinigungssäulen eluiert wird. (C) Fläschchen und Filter in Schaumstoffbehältern (1 und 2) mit Eis vor und nach Zugabe des Injektionslösungsmittels (MeOH-H2O 9:1, v/v) zu den 4-ml-Fläschchen auf eine Temperatur unter Null bringen. (D) Filtrieren von gekühltem Extrakt aus einem 4-ml-Fläschchen in ein 400-μl-Autosampler-Fläschchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Verwerfe die kombinierten Eluate. Die Aflatoxinfraktion durch Schwerkraft aus der Säule in ein sauberes 4-ml-Glasfläschchen mit einem Gemisch aus 1,2 ml Aceton-Acetonitril-Wasser-88 % Ameisensäure (65:31:3,5:0,5, v/v) eluieren (Abbildung 4A). Alternativ können Sie Aflatoxine aus der Säule mit 2,0 ml Acetonitril-Wasser-88%iger Ameisensäure (96:3,5:0,5, v/v) eluieren und ein Aliquot des Eluats, bis zu 2 μl, direkt in das Ultra-Performance-Flüssigchromatographie-System (UPLC) injizieren (ohne Verdampfung des Lösungsmittels mit N2).HINWEIS: In diesem Fall ist mit einer bis zu 10-fach niedrigeren Quantifizierungsgrenze für Aflatoxine zu rechnen; In den meisten Fällen ist ein solcher Abfall der Empfindlichkeit akzeptabel, da die Aflatoxinkonzentrationen im beanstandeten Saatgut oft hoch sind. Das Lösungsmittel wird in einem Strahl von N2 in einem erhitzten Block bei 45 °C aus den Durchstechflaschen entfernt. Verschließen Sie das Fläschchen und stellen Sie es für 30-45 s in einen Behälter mit zerstoßenem Eis, um die Verdunstung des Lösungsmittels, das im folgenden Schritt hinzugefügt wird, zu minimieren. Legen Sie speziell angefertigte Filter in Einweg-Reagenzgläser und setzen Sie die Röhrchen in Eis in einem anderen Behälter ein, um die Verdunstung des Lösungsmittels während der Filtration zu minimieren (Abbildung 4B, C). Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels den trockenen Rückstand in genau dosierten 0,25-1,0 mL Methanol-Wasser-Gemisch (90:10, v/v) auflösen und 1-2 s lang vortexen. Legen Sie die Fläschchen mit den gereinigten Extrakten in den UPLC-Autosampler und injizieren Sie 0,1 bis 3,0 μl in das UPLC-System (Abbildung 5A,B).HINWEIS: Wenn der Verdacht besteht, dass die Lösung nach dem Vortexen Schwebstoffe enthält, filtrieren Sie die Lösung durch den gekühlten Filter (Abbildung 4D). Abbildung 5: Der Prozess und die Ergebnisse der UPLC-Analysen von gereinigten Extrakten. (A) Platzieren eines Racks mit gereinigten Probenextrakten in den UPLC-Autosampler. (B) Durchführung der instrumentellen Analysen, Datenbeschaffung und Interpretation der Ergebnisse. (C) UPLC von vier wichtigen Aflatoxinen; die wichtigsten Peaks von Interesse, die Aflatoxine B1 und B2 , repräsentieren 0,04 bzw. 0,004 ng. d) UPLC der Aflatoxine B1 und B2, Peak 2 repräsentiert Aflatoxin B1 auf einem 2 pg-Niveau (mit einer 8 μL Durchflusszelle). (E) UPLC von gereinigtem Extrakt aus einem Samen, der von einem lokalen Erdnussfeld mit einer wilden Arachis-Art geerntet wurde. (F) UPLC des Extrakts eines angegriffenen Erdnusssamens, der mit einer basischen Aluminiumoxid-Minisäule gereinigt wurde. (G) UPLC des Extrakts aus befallenen Erdnusskernen, der mit einer Florisil-Säule gereinigt wurde; Das blaue Chromatogramm zeigt Verunreinigungen, die mit 1 ml Methanol-Wasser-Gemisch (90:10 V/V) aus der Säule gewaschen werden. Das schwarze Chromatogramm zeigt die Peaks der Aflatoxine M1 und B1. Der Gehalt an Aflatoxin B1 beträgt 48 ng/g. (H) Ein typisches Chromatogramm von Erdnuss-Stilbenoiden aus einem angegriffenen Samen; Abkürzung: IPD = 3′-Isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilben. Hinweis: Alle Stilbenoide in Samenextrakten sind in trans-Konfiguration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Für Phytoalexin-Analysen werden aus jedem Kügelchenfläschchen 200 μl Überstand in den oben genannten Pasteur-Pipettenfilter übertragen. Verwenden Sie N2 -Gas aus einem komprimierten Stickstofftank, um die Filtration in ein 400 μl UPLC-Autosampler-Fläschchen zu beschleunigen, und verschließen Sie das Fläschchen mit einer passenden Kappe mit einem PTFE-Septum (Abbildung 4D). 3. Aflatoxin-Analysen Für die Trennung von Aflatoxinen in Samenextrakten verwenden Sie ein UPLC-System, das mit einem Autosampler, einer quaternären Pumpe, einem Fluoreszenzdetektor, einer UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, 1,7 μm Säule mit passender Vorsäule und einem photochemischen Nachsäulenreaktor (PHRED) mit einer gestrickten Standard-PTFE-Spule mit 0,25 Innendurchmesser ausgestattet ist, die auf 25 % ihrer ursprünglichen Länge geschnitten ist.HINWEIS: Das UPLC-Gerät und die zugehörigen Geräte, die von den Autoren verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Verwenden Sie Wasser (A), Methanol (B) und Acetonitril (C) in folgendem Gradienten: Anfangsbedingungen, 62,7 % A, 24 % B, 13,3 % C, linear geändert auf 30 % A, 45 % B, 25 % C in 3,75 min, geändert auf 0 % A, 64,4 % B, 35,6 % C in 3,751 min, isokratisch gehalten für 3,249 min, dann in 0,01 min auf Anfangsbedingungen geändert und vor der nächsten Injektion 2,499 min isokratisch gehalten. Stellen Sie die Flussrate auf 0,45 mL/min und die Laufzeit auf 9,5 min ein. Halten Sie die Säule auf 40 °C in der Säulenheizung des Systems. Verwenden Sie 362 nm bzw. 440 nm als Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen für die Quantifizierung der Aflatoxine B1, B2, G1, G2 und M1 . Die Strukturen der wichtigsten Aflatoxine sind in Abbildung 6A dargestellt.HINWEIS: Unter den Versuchsbedingungen ist davon auszugehen, dass nur die Aflatoxine B1 und B2 von A. flavus NRRL 3357 produziert werden. Wenn ein A. parasiticus-Stamm für die Saatgutherausforderung verwendet wird, ist die Produktion der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 zu erwarten. Bestimmen Sie die Konzentrationen von Aflatoxinen unter Bezugnahme auf die Peakbereiche entsprechender authentischer Standards (Kalibrierkurve), wie in der Bedienungsanleitung der Software beschrieben.HINWEIS: Da das UPLC-Verfahren bei den hohen Empfindlichkeitseinstellungen für den Fluoreszenzdetektor ein Basisrauschen aufweist, werden die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) für Aflatoxine unter Verwendung des weithin akzeptierten Signal-Rausch-Verhältnisses von 3:1 für LOD und 10:1 für LOQ bewertet. In dem in den Abschnitten 2 und 3 beschriebenen routinemäßigen Versuchsaufbau für die Analyse von Erdnusskernen wird erwartet, dass die Bestimmungsgrenzen für die Aflatoxine G1 und B1 kleiner oder gleich 0,8 ng/g für die Aflatoxine G2 und B2 sind. 4. Stilbenoid-Phytoalexin-Analysen Zur Trennung von Stilbenoiden verwenden Sie Wasser (A), Methanol (B) und 88 % Ameisensäure (C) in folgendem Gradienten: Anfangsbedingungen, 53 % A, 42 % B, 5 % C, linear geändert zu 35 % A, 60 % B, 5 % C in 2,0 min, isokratisch gehalten für 4 min, geändert zu 0 % A, 95 % B, 5 % C in 0,5 min, isokratisch gehalten für 2,5 min, wechselte dann in 0,1 min zu den Anfangsbedingungen und hielt isokratisch für 2,9 min vor der nächsten Injektion. Stellen Sie die Flussrate auf 0,5 mL/min und die Laufzeit auf 12,0 min ein. Bestimmen Sie die Konzentrationen von Stilbenoiden unter Bezugnahme auf Peakbereiche entsprechender authentischer Standards (Kalibrierkurve) und/oder auf veröffentlichte Koeffizienten der molaren Extinktion, wie im Benutzerhandbuch der Software beschrieben. Die Strukturen der wichtigsten aus Stilben gewonnenen Phytoalexine sind in Abbildung 6B dargestellt.HINWEIS: Die Trennung von Phytoalexinen erfolgt mit dem gleichen System, jedoch ohne Fluoreszenzdetektor und PHRED-Reaktor. Stattdessen wird ein Diodenarray-Detektor für den Nachweis und die Quantifizierung von Erdnuss-Stilbenoiden verwendet. Die Bestimmungsgrenze (LOQ) für die wichtigsten Stilbenoid-Phytoalexine hat keine praktische Bedeutung, da die Stilbenoidkonzentrationen die Konzentrationen von Aflatoxinen im selben Extrakt um einige Größenordnungen übersteigen; Nach 3 Tagen Inkubation sind die Stilbenoide zuverlässig quantifiziert.

Representative Results

Die entwickelte Methode zur Aflatoxin-Quantifizierung in Saatgut ist der Kern des gesamten Verfahrens zur Bewertung von wilden Erdnussarten auf Resistenz gegen Aflatoxinakkumulation. Speziell verpackte Minisäulen und Filter bieten erhebliche Einsparungen und vereinfachen das Gesamtverfahren aufgrund des Fehlens großer Mengen an Lösungsmitteln, teurer und unnötiger kommerzieller 0,22- oder 0,45-μm-Filter und Pumpvorrichtungen. Die Methode zur Aflatoxinanalyse bietet eine hohe Wiederfindung, Genauigkeit und Präzision innerhalb des getesteten Bereichs von 1,0-50,0 ng/g Aflatoxine aus gemahlenem Saatgut, wie in Tabelle 1 zu sehen ist. Stark kontaminierte Proben wurden auf den linearen Testwert verdünnt. Abbildung 5C zeigt eine Ausgangstrennung der vier wichtigsten Aflatoxine, B1, B2, G1 und G2 , innerhalb einer Elutionszeit von 5 Minuten, was akzeptabel ist, da die pilzliche Herausforderung von Erdnusssamen die begrenzende Phase des Verfahrens ist und nicht UPLC-Analysen. Die vorgeschlagene Methode ist mit einer Bestimmungsgrenze von 2 pg für Aflatoxin B1 ausreichend sensitiv (Abbildung 5D). Die hohe Reinheit der Extrakte ermöglicht eine eindeutige Quantifizierung von Aflatoxinen, wie sie aus einem UPLC (Abbildung 5E) von gereinigtem Extrakt von Samen hervorgeht, die von einem Feld mit einer wilden Arachis-Art geerntet wurden. Eine früher veröffentlichte Minisäulenmethode29 ist nicht in der Lage, eine zufriedenstellende Reinheit für pilzgefährdete Erdnusssamen (Abbildung 5F) im Vergleich zu der vorgeschlagenen Methode (Abbildung 5G) zu erreichen. Aus Abbildung 5F ist ersichtlich, dass die AflatoxineB2, G1 und G2 aufgrund des Vorhandenseins hoher Konzentrationen von störenden Verunreinigungen, von denen viele, nach Aflatoxinen eluiert, Stilbenoid-Phytoalexine und Pilzmetaboliten sind, nicht zuverlässig nachgewiesen und quantifiziert werden können. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 5G die hohe Effizienz der Magnesium-Kieselgel-Säule bei der Entfernung von Verunreinigungen aus der Aflatoxinfraktion. Das blaue Chromatogramm zeigt störende Verunreinigungen, die mit 1 ml Methanol-Wasser-Gemisch (90:10) aus der Säule gewaschen werden; Das schwarze Chromatogramm zeigt unverdeckte Peaks der Aflatoxine M1 und B1. Dieses Chromatogramm stellt den Extrakt aus dem Samen einer beanstandeten Wildart dar. Der Gehalt an Aflatoxin B1 beträgt 48 ng/g. Die Quantifizierung von Erdnuss-Phytoalexinen ist eine wertvolle Ergänzung zur Analyse von Aflatoxinen im selben Samen, bei dem es sich um ein natürliches Saatgut von einem Feld oder ein pilzbefallenes Saatgut handeln kann. Abbildung 5H zeigt ein typisches Chromatogramm von Erdnuss-Abwehrstilbenoiden aus einem angegriffenen Samen. Die Trennung der Verbindungen erfolgt mit der gleichen analytischen Säule, die auch für Aflatoxinanalysen verwendet wird. Die Säule und die gewählten chromatographischen Bedingungen sorgen für eine zufriedenstellende Trennung der Peaks, was eine zuverlässige Quantifizierung der Stilbenoide ermöglicht. Die Bewertung der Aflatoxin-Phytoalexin-Beziehung in beanstandeten Samen würde den Rahmen dieser Präsentation sprengen und die Methode wird hier als potenzielles Forschungsinstrument vorgeschlagen, das seit mehreren Jahren im Labor der Autoren eingesetzt wird und sich als nützlich erwiesen hat. <!– Figure 1: Single-seed analysis flowchart. (A) Comparative size of different market-type peanut cultivars vs. wild Arachis spp. (1) Virginia; (2) runner; (3) Spanish; (4) wild Arachis spp. (B) Wild Arachis spp. seed 4 cut into three sections, (5) half seed with embryonic axis; this portion of the seed is used to grow a plant (E). (C) Parts (6) and (7) are drilled with a drill bit and (D) inoculated with fungal spores. After incubation for 72h at 30 oC, one of the seed parts, (6) or (7) is used for aflatoxin and phytoalexin analyses, and another is used for RNA/transcriptome sequencing. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2: Preparation of peanut seeds for inoculation, incubation, and extraction of aflatoxin and phytoalexin fractions. (A) Sterilizing imbibed seeds with 3% hydrogen peroxide; (B) removing skins from seeds; (C) cutting off the embryonic axis part; (D,E) drilling cavity in a half cotyledon with a drill bit; (F) placing drilled parts of seeds on agar; (G) applying fungal spored into drilled cavity. (H) Petri dish with seeds after incubation; (I) placing incubated single seeds (photo of control samples) into beading vials; (J) adding measured volume of extracting solvent; (K) pulverizing samples in a bead raptor; ( L) centrifugation of pulverized slurry. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3: Preparation of cleanup columns and filters. (A,B) Placing a porous frit into barrel; ( C,D) filling barrel with magnesium silica gel; (E) packing the adsorbent and inserting a top porous frit into barrel. (F) Placing an 11.5 mm dia. glass fiber circle on top of a Pasteur pipette. (G,H) Pushing the center of the circle with a plastic or wooden rod down to the bottom of the Pasteur pipette barrel and firmly compacting the glass fiber. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4:Purification of seed extracts and preparation for the UPLC analyses. (A)Rack with packed columns. (B) Evaporating solvent with N2 gas from six 4 mL vials with purified extract eluted from cleanup columns. (C) Bringing vials and filters to a subzero temperature in foam containers (1 and 2) with ice before and after addition of the injection solvent (MeOH-H2O 9:1, v/v) to the 4-mL vials. (D) Filtering cooled extract from a 4-mL vial into a 400 µL autosampler vial. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 5: The process and results of UPLC analyses of purified extracts. (A) Placing a rack with purified sample extracts into UPLC autosampler. (B) Performing the instrumental analyses, obtaining data, and interpreting results. (C) UPLC of four major aflatoxins; the major peaks of interest, aflatoxins B1 and B2 represent 0.04 and 0.004 ng, respectively. (D) UPLC of aflatoxins B1 and B2; peak 2 represents aflatoxin B1 at a 2 pg level (with an 8 µL flow sell). (E) UPLCof purified extract of a seed harvested from a local peanut field with a wild Arachis species. (F) UPLC ofthe extract of a challenged peanut seed purified with a basic aluminum oxide minicolumn. (G)UPLC of the extract of challenged peanut seed purified with a Florisil column; blue chromatogram presents impurities that are washed from the column with 1 mL of methanol-water (90:10 v/v) mixture; black chromatogram shows peaks of aflatoxins M1 and B1. The level of aflatoxin B1 is 48 ng/g. (H) Atypical chromatogram of peanut stilbenoids from a challenged seed; abbreviation: IPD = 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbene. Note: All stilbenoids in seed extracts are in trans-configuration. Please click here to view a larger version of this figure. –> Abbildung 6: Strukturen der wichtigsten Aflatoxine und der von Stilben abgeleiteten Erdnuss-Phytoalexine. (A) Strukturen der wichtigsten Aflatoxine: 1, B1; 2, B2; 3, G1; 4, G2. (B) Strukturen der wichtigsten aus Stilben gewonnenen Erdnuss-Phytoalexine: 6, Resveratrol; 7, Arachidin-1; 8, Arachidin-2; 9, Arachidin-3; 10, IPD (3′-Isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilben); 11, SB-1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. StachelStufe a(ng/g) Aflatoxine B1 B2 G1 G2 50 85.87 (0.97) 82.33 (0.67) 86.63 (2.89) 84.01 (0.86) 5 91.43 (2.76) 87.32 (0.47) 88.08 (2.08) 87.73 (0.77) 1 81.21 (3.16) 85.33 (1.98) 81.76 (4.66) 88.46 (3.24) Tabelle 1: Rückgewinnung von Aflatoxinen aus Erdnusssamen unter Verwendung der Florisil-Säule und 1,2 ml des Aflatoxin-Fraktionselutionsgemisches. [Mittelwert (SD), %; n = 5]. Aflatoxinfreie gemahlene Proben (50 g) der Erdnusssorte Georgia 06G wurden mit Hilfe einer Mikrospritze mit Aflatoxin-Stammlösung in einem Gehalt von 50, 5 oder 1 ng/g gleichmäßig versetzt und 16 h lang bei Raumtemperatur belassen. Für die AflatoxineB2 undG2 sollte der Multiplikationsfaktor von 0,33 verwendet werden.

Discussion

Basierend auf unseren bisherigen Erfahrungen²⁸ haben wir ein einfaches, kostengünstiges, umweltfreundliches, chemisches Verfahren entwickelt, das sich für die Erforschung von wilden Arachis-Keimplasmasammlungen eignet, um gegen Aspergillus resistente Arten zu identifizieren und neue Quellen genetischer Resistenz gegen diesen opportunistischen Pilz zu bestimmen und zu charakterisieren. Diese Methode basiert auf der Aufreinigung von Samenextrakten durch eine Festphasenextraktionstechnik (SPE) und der Aflatoxinquantifizierung durch Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) und zeichnet sich durch eine ausreichend hohe Wiederfindung, Präzision und Genauigkeit aus. Die vorgeschlagene “Florisil”-Methode ist eine Modifikation des Ein-Minisäulen-Reinigungsverfahrens, das auf der einzigartigen Eigenschaft von Florisil (Magnesium-Kieselgel) basiert, Aflatoxine stark und selektiv zurückzuhalten²⁸. Wie bei der ursprünglichen Methode wurden die Samenproben mit einem MeOH-H₂O-Gemisch extrahiert, jedoch in einem anderen Verhältnis von 90:10 (v/v) als das veröffentlichte 80:20 (v/v). Diese Änderung hat die Durchflussrate von Lösungsmitteln durch die Reinigungssäule um das 2,5-fache bei gleicher Aflatoxin-Rückgewinnungsrate erhöht. Dieses Methanol-Wasser-Gemisch von 90:10 (v/v) lieferte eine nahezu 100%ige Rückgewinnung der Aflatoxine B₁, B₂, G₁ und G₂, die der Extraktion von Lösungsmitteln in Spike-Konzentrationen zugesetzt wurden, die 5-50 ng Aflatoxinkonzentrationen in 1 g eines Substrats entsprachen, und lieferte eine ausreichend hohe Wiederfindung aus den mit Stacheln versetzten Erdnusssamenproben (Tabelle 1).

Es wurde gezeigt, dass Aflatoxine aus dem Florisil-Adsorptionsmittel nur mit großen Mengen an Aceton³⁰, Aceton-Methanol ^31,32 und Aceton-Wasser-Gemischen 33,34,35,36 eluiert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Forschung haben wir entdeckt, dass sich angesäuertes Acetonitril in seiner Fähigkeit, Aflatoxine aus Florisil zu eluieren, ähnlich wie Aceton verhält. Unseres Wissens ist diese Eigenschaft von Acetonitril in der Literatur nicht bekannt. Die Entdeckung dieser Eigenschaft ermöglicht es, gereinigten Extrakt direkt in das UPLC-System zu injizieren, ohne den Lösungsmittelverdampfungsschritt zu unterbrechen, was die Vorbereitungszeit erheblich verkürzt. Selbst wenn Acetonitril mit Aceton (Aceton-Acetonitril-Wasser-88% Ameisensäure (65:31:3,5:0,5, v/v)) gemischt wurde, ermöglichte es eine reibungslose, vollständige und schnelle Entfernung von Wasser aus den gereinigten Eluaten, wodurch die Verdampfungszeit des Lösungsmittels erheblich verkürzt wurde. Das Vorhandensein von Acetonitril ermöglichte die Verwendung eines einzigen Lösungsmittel-Methanol-Wasser-Gemisches (90:10, v/v), um Verunreinigungen effektiv aus der Florisil-Säule zu entfernen, verglichen mit einer veröffentlichten Methode, bei der zwei zusätzliche Waschlösungsmittel, Methanol und Chloroform-Methanol-Gemisch, erforderlich waren. ²⁸

Im Durchschnitt betrug die Standard-Wiederfindung von Aflatoxin B₁ ~98%, wenn 1,2 ml für die Elution von Aflatoxinen verwendet wurden. Die Menge von 50 mg Florisil wurde so gewählt, dass 1,2 ml des Elutionslösungsmittels die Minisäule bis zum oberen Rand des Zylinders füllten und gleichzeitig eine zufriedenstellende Wiederfindung ergaben (Tabelle 1). Dieser Ansatz beschleunigt das Reinigungsverfahren, da das Säulenfass nur einmal gefüllt werden muss. In der Anfangsphase dieses Projekts war nicht klar, ob eine kommerzielle Florisilfraktion mit einer relativ großen Partikelgröße von 100-200 mesh für eine kleine Säule geeignet wäre, die nur eine 3 mm dicke Schicht des Adsorptionsmittels enthält. Aus diesem Grund untersuchten wir verschiedene Florisil-Fraktionen, die aus einem kommerziellen Produkt mit 100-200 Mesh unter Verwendung der US-amerikanischen Standard-Reagenziensiebe 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 und >400 Mesh gewonnen wurden. Alle diese Fraktionen lieferten reproduzierbare, nahezu übereinstimmende Ergebnisse mit zufriedenstellender Wiederfindung. Obwohl kleinere Fraktionen mit Partikelgröße unter UV-Licht schmalere Aflatoxinbanden in der Säule aufwiesen, waren diese Fraktionen in keiner Weise dem kommerziellen Produkt mit 100-200 Mesh überlegen. Darüber hinaus zeigte die 100-200-Mesh-Fraktion die kürzesten Elutionszeiten (8-12 min) für das gesamte Verfahren.

Die Gradienten-UPLC-Lösungsmittelzufuhr ermöglichte eine zufriedenstellende Trennung von Aflatoxinen sowie die vollständige Entfernung unpolarer Verunreinigungen aus der Säule (Abbildung 5G). Dieser Ansatz führte zu einem einwandfreien Betrieb der Säule und reproduzierbaren Ergebnissen der Analysen von Hunderten von Proben. Die Identität der aus der Florisil-Säule eluierten Aflatoxine wurde wie zuvor beschrieben bestätigt. ²⁸ Die hier verwendete analytische UPLC-Säule mit einem Durchmesser von 3 mm zeigte eine höhere Selektivität und eine zuverlässigere Trennung der Aflatoxine B₁, B₂, G₁ und G₂ bei höheren Konzentrationen im Vergleich zur Säule mit einem Durchmesser von 2,1 mm derselben Chemie. Darüber hinaus war die Langlebigkeit der 3-mm-Säule (über 1.200 Injektionen) wesentlich höher als die der 2,1-mm-Säule (bis zu 800 Injektionen). Obwohl die 3-mm-Säule eine höhere Rate der mobilen Phase erforderte (40% mehr), wurde dieser Nachteil durch die oben genannten Vorteile der Säule übertroffen.

Die Florisil-Minisäule erwies sich als wirksam für die Reinigung von Extrakten aus Erdnusssamen, die stark mit Aspergillus-Metaboliten kontaminiert waren (Abbildung 5G); Solche Samen enthielten auch einen hohen Gehalt an Stilbenoid-Phytoalexinen, die von den Samen als Reaktion auf die Pilzinvasion produziert wurden. Alle diese Verunreinigungen können die Aflatoxinkonzentration in den Samen um das 10-^bis 6-fache²² überschreiten, was diese Samen zu schwierigen Objekten für Aflatoxinanalysen macht. Abbildung 5G zeigt das Fehlen von störenden Peaks im Chromatogramm innerhalb der Aflatoxin-Retentionszeiten, was den Aflatoxinnachweis und die Quantifizierung auf allen getesteten Ebenen kompromisslos machte (Tabelle 1). Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, waren die Genauigkeit und Präzision der Methode innerhalb des getesteten Bereichs von 1,0-50,0 ng/g, der auch der kritischste Bereich für den Aflatoxin-Nachweis ist, ausreichend hoch. Die Wiederfindungsraten auf verschiedenen Ebenen für verschiedene Wilderdnuss-Genotypen waren einheitlich und die Standardabweichungen für fünf verschiedene Extraktionen waren im Wesentlichen gering.

Die Methode wurde auch an Erdnuss-, Baumwoll-, Mais- und Reissamen getestet, die auf natürliche Weise von null bis zu extrem hohen Konzentrationen von über 10.000 ng/g Gesamtaflatoxinen kontaminiert waren. Die Wiederfindung der Aflatoxine B₁, B₂, G₁ und G₂ aus Mais, Baumwollsamen und Reis im Bereich von 5 ng/g schwankte zwischen 76,1 % und 93,7 %, 77,1 % bis 86,6 % bzw. 90,5 % bis 96,2 %. Die höchste Rückgewinnung von Aflatoxinen aus Reis ging einher mit der “Reinheit” des Eluenten, d.h. praktisch dem Fehlen jeglicher Verunreinigungen. Darüber hinaus stellte Reis mit durchschnittlich 19 mg/Saatgut das kleinste getestete Einzelobjekt dar.

Die Gesamtvorbereitungszeit für einen einzelnen Erdnusskern (einschließlich Schälen, Wiegen, Extraktion, Zentrifugation und Reinigung) mit einer Florisil-Säule betrug nicht mehr als 20 Minuten. Die Kosten für die Florisil Minisäule sind >10x niedriger als die für kommerzielle Reinigungssäulen. Zusätzliche Einsparungen ergeben sich aus der Verwendung geringerer Volumina an Adsorbentien, Lösungsmitteln und Stickstoffgas im Vergleich zum veröffentlichten Verfahren²⁸. Die Minisäule benötigt keine Pump- oder Vakuumvorrichtungen, um zu funktionieren, und hat eine unbegrenzte Haltbarkeit.

Die Untersuchung von pflanzlichem Keimplasma auf Resistenz gegen Aflatoxine ist außerordentlich schwierig, da die Mykotoxinakkumulation nicht einer Normalverteilung folgt^37,38; Um dieses Phänomen zu überwinden, ist eine große Anzahl von Aflatoxin-Analysen in einzelnen Samen erforderlich. Neben dem Aflatoxingehalt sind Informationen über die quantitative Phytoalexinzusammensetzung sehr wertvoll, da eine große Menge an Informationen aus einem einzigen Samen gewonnen und auf eine bestimmte Pflanze (Abbildung 1E) zurückgeführt werden kann. Die Methode wurde erfolgreich für das Screening von Hunderten von Akzessionen eingesetzt, darunter Landrassen, fortschrittliche Zuchtlinien und Elite-Erdnusssorten. Die Methode wird für den Einsatz in Erdnussvorzucht- und -züchtungsforschungsprogrammen empfohlen und kann bei der Charakterisierung von Erdnussgenen für Pilzresistenz helfen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung des USDA-ARS CRIS-Projekts 6044-42000-011-00D und des CRIS-Projekts 6044-21000-005-000-D. Wir danken Dan Todd für die Herstellung des Minisäulen-Haltegestells Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in diesem Artikel dient ausschließlich dem Zweck, spezifische Informationen bereitzustellen, und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium.

Materials

Acetone, Optima	Fisher Scientific	A929-4
Acetonitrile, Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard pre-column	Waters Corporation	186003975
Acquity BEH C18 3 x 100mm column	Waters Corporation	186004661
Acquity BEH C18 2.1 x 100mm column	Waters Corporation	186002352
Aflatoxins B1, B2, G1, and G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	Dissolve the contents of the commercial vial in 5 mL of methanol to obtain 5 µg/mL for aflatoxins B1 and G1 and 1.5 µg/mL for B2 and G2
Aflatoxin B1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A6636-1MG
Aflatoxin B2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A9887-1MG
Aflatoxin G1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0138-1MG
Aflatoxin G2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0263-1MG
Aflatoxin M1 (10 µg)	Sigma-Aldrich	CRM46319
Agar, Granulated (2kg)	Becton Dickinson	BD214510
Alumina oxide basic (60-325 mesh)	Fisher Scientific	A941-500
Basal medium	Murashige and Skoog	M5519
Bead Ruptor 24	Omni International	19-042E
Beaker (1000mL)	Corning (Pyrex)	10001L
Beaker (250mL)	Corning (Pyrex)	1000250
Beaker (400mL)	Corning (Pyrex)	1000400
Beaker (600mL)	Corning (Pyrex)	1000600
Blade, scalpel	Feather	#10
Centrifuge (LSE Compact)	Corning	Model: 6755
Centrifuge, micro	Corning	Model: 6770
Ceramic beads (2.8 mm)	Omni International	19-646
Ceramic beads (6.5 mm)	Omni International	19-682
Chromeleon 7 series Software	Thermo Scientific
Drill bit	Kyocera	07896	1.6 mm
Drill bit	Kyocera	07357	2.0 mm
Drill bit	Kyocera	07985	2.34 mm
Ethanol (200 proof)	Decon Labs	2805M
Evaporator, nitrogen	organimation	11106	6-position
Excel, Microsoft	Microsoft	Office 365
Filter paper (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
Filter paper cutter, stainless steel (ID 11.5mm)	Unknown
Filter paper, glass fibre	Cytiva Whatman	934-AH
Flask (2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (100-200 mesh)	Fisher Scientific	F101-500
Forceps	Integra Lifescience (Miltex)	PM-0300
Formic acid (88%, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
Freezer (-80^oC)	Fisher Scientific	TSX70086D
Funnel (15 x 80mm)	DWK Life Sciences (Kimax)	2902060
Gelzan (medium)	Caisson Labs	G024
Glass rod (custom)	Custom made
Glass wool	Corning (Pyrex)	3950
Handle, scalpel	Feather	#7
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325-4	30%, Certified ACS
Ice bucket, round with lid	Corning	432122
Incubator	Percival	136VL
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes	Kimtech	34120	8.2" x 4.39"
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes	Kimtech	34256	16.4" x 14.43"
Lab coat	Cenmed	B113660SBXL
Methanol, Optima	Fisher Scientific	A454-4
Mini column rack (custom)	Custom made
Mixer, touch (maxi mix II)	Thermolyne	37600 (model 231)
Nitrile gloves	Microflex	XC310M
Nitrogen gas, compressed (ultra high purity)	Jones Welding
Paper towel	Georgia-Pacific	20023 (D400)
pH meter	Fisher Scientific (Accumet)	13-636-AB15
pH/ATC electrode	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-111
PhCR Photochemical Reactor	Waters (Vicam)	600001222
Pipette, pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	9"
Pipettor (1 mL) (Reference 2)	Eppendorf	4924000088
Pipettor (10 μL) (Reference)	Eppendorf	022470051D
Pipette tips: 10 μL, 200 μL, 1 mL	Eppendorf	F144054M
Pipettor (200 µL)(Ergofit)	Fisher Scientific	12-146-679
Plates, petri (100x15mm)	Fisher Scientific	FB0875713
Potato Dextrose Agar (500g)	Becton Dickinson	BD213400
Reinforced bead tube (2 mL)	Omni International	19-660
Reinforced bead tube (7 mL)	Omni International	19-651
Repipettor, Dispensette III (10mL)	Brandtech	4701141
Resveratrol	Sigma-Aldrich	R5010-100MG
Scoop (custom)	Custom made
screwcap jar (250 mL)	Corning (Pyrex)	1395250
Silica gel, spherical (200-400 mesh)	Supelco	97727-U	100 g
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
SPE extract clean 1.5-mL polypropylene column	American Chromotography Supplies	SP-5122382
SPE extract clean PP frits (for 1.5 mL minicolumn)	American Chromotography Supplies	SP-3119414
Spectrophotometer, UV-visible	Fisher Scientific	14-385-351 (Genesys 50)
Test tube	Corning (Pyrex)	982516X	16x125mm
Test tube (Disposable)(16x125mm)	Fisher Scientific	14-961-31
Test tube (Disposable)(150x250mm)	Fisher Scientific	14-961-34
Thermo Vanquish DAD detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D51-A
Thermo Vanquish quaternary pump F (UPLC)	Thermo Scientific	VF-P20-A
Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)	Thermo Scientific	VF-A10-A-02
Tween 20 (polysorbate 20) (enzyme grade)	Fisher Scientific	BP337-500
Vial caps (4mL)	Fisher Scientific	C4015-75A
Vial caps (autosampler)	Fisher Scientific	C4010-60A
Vials & caps (16 mL)	Thermo Scientific	B7800-4
Vials, glass (4mL)	Fisher Scientific	C4015-1
Vials, polypropylene (autosampler) (400mL)	Fisher Scientific	C4010-11
Water, Optima	Fisher Scientific	W6-4

Riferimenti

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Sobolev, V. S., Arias, R. S., Massa, A. N., Walk, T. E., Orner, V. A., Lamb, M. C. Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds. J. Vis. Exp. (206), e66574, doi:10.3791/66574 (2024).