FRET를 사용한 살아있는 세포의 고삼투압 스트레스에 대한 반응으로 본질적으로 무질서한 영역의 구조적 민감도 추정
Summary
내재적 무질서 영역(IDR)은 환경 변화에 대응하여 형태를 수정하는 유연한 단백질 도메인입니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 다양한 조건에서 단백질 치수를 추정할 수 있습니다. 우리는 고삼투압 스트레스 하에서 살아있는 맥주효모균 세레비지애 세포의 IDR 구조적 민감도를 평가하기 위한 FRET 접근법을 제시합니다.
Abstract
내재적 무질서 영역(IDR)은 중요한 세포 과정에 관여하는 단백질 영역입니다. 스트레스 조건 동안 세포 환경의 물리화학적 특성이 변하여 IDR의 구조적 앙상블에 직접적인 영향을 미칩니다. IDR은 본질적으로 환경 섭동에 민감합니다. 세포의 물리화학적 특성이 IDR의 구조적 앙상블을 어떻게 조절하는지 연구하는 것은 IDR 기능의 환경적 제어를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에서는 고삼투압 스트레스 조건에 반응하여 살아있는 맥주효모균 세포 에서 IDR의 구조적 민감도를 측정하는 단계별 방법을 설명합니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 사용하여 삼투질이 있는 세포에 가해지는 고삼투압 스트레스가 점진적으로 증가하는 동안 IDR의 전체 치수가 어떻게 변하는지 추정합니다. 또한 형광 측정을 처리하고 다양한 IDR에 대한 구조적 감도를 비교하기 위한 스크립트를 제공합니다. 이 방법을 따름으로써 연구자들은 환경 변화에 따라 복잡한 세포 내 환경에서 IDR이 겪는 구조적 변화에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Introduction
본질적으로 무질서한 영역(Intrinsically disordered regions, IDR)은 세포 과정의 중요한 구성 요소입니다1. 구조화된 도메인과 함께 IDR은 단백질 기능에 필수적입니다. IDR의 아미노산 조성은 편향되어 있으며, 주로 하전, 친수성 및 작은 잔류물로 대표됩니다. 이 속성 때문에 IDR은 복잡성이 낮은 도메인 2,3으로 간주됩니다. 수많은 IDR이 주목을 받고 있는데, 이는 주로 이 부위가 병리학적 상태, 특히 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 하기 때문입니다. 이러한 질환은 뉴런에서 IDR의 자가 조립(self-assembly)과 그에 따른 세포외 또는 세포내 침착(extracellular 또는 intracellular deposition)을 특징으로 한다4. 이러한 IDR의 예로는 알츠하이머병의 아밀로이드-β(Aβ), 헌팅턴병의 헌팅틴(HTT), 근위축성 측삭 경화증 및 전두측두엽 치매의 육종(FUS)에서 융합된 TAR DNA 결합 단백질-43(TDP-43) 및 융합 등이 있다4. 질병의 맥락에서 IDR의 구조적 재배열에 대한 연구는 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 포함한 분광법에 의해 크게 향상되었습니다.
IDR의 친수성 및 확장 특성으로 인해 용액 환경의 물리화학적 특성 변화에 매우 민감합니다5. IDR의 구조적 앙상블이 환경에 의해 변형되는 정도를 구조적 민감도 5,6,7이라고 합니다. 원형 이색법(CD) 및 소각 X선 산란(SAXS)8,9을 포함하여 IDR의 형태와 역학을 연구하는 데 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 안타깝게도 CD와 SAXS는 정제된 단백질을 대량으로 필요로 하기 때문에 세포 연구에는 적합하지 않습니다. 대조적으로, FRET는 하나의 IDR을 특이적으로 표지하는 두 형광 분자의 형광 강도를 측정하는 기술이며, 이는 살아있는 세포(10)와 같은 복잡한 혼합물에서 모니터링할 수 있음을 의미합니다. 살아있는 세포에서 IDR의 구조적 민감도를 동적으로 측정하는 것은 환경이 무질서한 단백질체의 형태와 기능을 어떻게 조절하는지 이해하는 데 필요합니다.
FRET는 살아있는 세포의 구형 및 다영역 단백질뿐만 아니라 IDR의 구조적 민감도를 정량화하는 강력한 방법입니다. 이 방법에는 FRET 쌍으로 알려진 두 개의 형광 단백질(FP) 사이에 끼워진 관심 IDR로 구성된 구성이 필요합니다. 이 프로토콜의 경우, IDR 민감도에 대한 이전 연구에서 보고된 다른 FP와 비교하여 동적 범위가 넓기 때문에 mCerulean3를 공여체 FP로, 황수정을 수용체 FP로 사용할 것을 제안합니다6. FRET는 이전에 다양한 세포 환경에서 식물 IDR의 구조적 민감도를 측정하는 데 활용되었습니다6. 또한, 이 기술은 in vitro 및 in vivo 5,11 모두에서 다양한 연구 그룹에 의해 IDR의 전체 단백질 치수를 특성화하는 데 사용되었습니다.
여기에서는 살아있는 효모(Saccharomyces cerevisiae) 세포에서 IDR의 구조적 민감도를 연구하기 위한 앙상블 FRET 방법을 설명합니다. AtLEA4-5라는 플랜트 IDR을 기반으로 하는 대표적인 결과를 보여줍니다. AtLEA4-5는 용액에서 무질서하지만, 시험관 내에서 고분자 군집이 유도되면 α나선으로 접힌다 12. AtLEA4-5는 상대적으로 작고(158개 잔기), 무질서하며 in silico 및 in vitro 6,12에서 보고된 바와 같이 환경 섭동에 민감하기 때문에 이 방법에 대한 좋은 참조 모델입니다. 여기에 제시된 방법은 효모 세포가 성장하기 쉽고 처리가 소량으로 적용되기 때문에 고처리량 접근법에 맞게 확장할 수 있습니다. 또한, 프로토콜에 대한 작은 변형은 박테리아 및 식물 세포와 같은 다른 세포 시스템에 적용될 수 있다6. 이 프로토콜은 대부분의 연구 기관에서 사용할 수 있는 장비인 형광 모드가 있는 마이크로플레이트 리더에 액세스할 수 있는 모든 분자 생물학 실험실에서 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 방법은 IDR 앙상블의 전역 차원이 환경 섭동을 감지하고 반응하는 방법에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 유전적으로 인코딩된 구조에 의존하며 효모 세포에서 플라스미드 안정 발현 이외의 추가 구성 요소가 필요하지 않으므로 다른 세포 유형의 잠재적 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 또한, 진핵 세포가 수명주기 동안 경험하는 다른 물리 화학적 섭동?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고를 비판적으로 검토해 주신 Cuevas-Velazquez 연구실 관계자분들께 감사드립니다. 이 작업은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) 프로젝트 번호 IA203422의 지원을 받았습니다. Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), 프로젝트 번호 252952; 및 Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET(CVU 1083636) 및 CAPD(CVU 1269643)는 CONAHCYT를 M.Sc 장학금으로 인정합니다.
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
Riferimenti
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
- Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
- Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
- Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
- Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
- Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
- Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
- Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
- Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
- Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
- Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
- Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
- JoVE Science Education Database. . Restriction enzyme digests. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Gel purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA ligation reactions. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Plasmid purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA gel electrophoresis. , (2023).
- JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides – Concept Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023)
- Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
- Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
- Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
- Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
- Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
- Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetica. 192 (2), 289-318 (2012).
- Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
- Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
- Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
- Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).
