Estimativa da Sensibilidade Estrutural de Regiões Intrinsecamente Desordenadas em Resposta ao Estresse Hiperosmótico em Células Vivas Utilizando FRET

Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são componentes críticos nos processos celulares¹. Em combinação com domínios estruturados, as IDRs são essenciais para as funções proteicas. A composição de aminoácidos das IDRs é tendenciosa, representada principalmente por resíduos carregados, hidrofílicos e pequenos. Devido a essa propriedade, os IDRs são considerados domínios de baixa complexidade ^2,3. Numerosas IDRs têm chamado a atenção, principalmente porque essas regiões desempenham um papel crucial em condições patológicas, particularmente doenças neurodegenerativas. Tais doenças caracterizam-se pela automontagem e subsequente deposição extracelular ou intracelular de IDRs nos^neurônios4. Exemplos dessas IDRs incluem β amiloide (Aβ) na doença de Alzheimer, huntingtina (HTT) na doença de Huntington e proteína ligadora de DNA TAR-43 (TDP-43) e fusionadas em sarcoma (FUS) na esclerose lateral amiotrófica e demência frontotemporal⁴. O estudo dos rearranjos estruturais das IDRs no contexto da doença tem sido significativamente aprimorado por métodos espectroscópicos, incluindo a transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET).

A natureza hidrofílica e estendida das IDRs as torna extremamente sensíveis a mudanças nas propriedades físico-químicas do ambiente de solução⁵. O grau pelo qual o conjunto conformacional das IDRs é modificado pelo ambiente é chamado de sensibilidade estrutural ^5,6,7. Diferentes técnicas podem ser utilizadas para estudar a conformação e a dinâmica das IDRs, incluindo dicroísmo circular (CD) e espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS)^8,9. Infelizmente, CD e SAXS requerem grandes quantidades de proteínas purificadas, por isso não são apropriados para estudos em células. Em contraste, o FRET é uma técnica que mede a intensidade de fluorescência de duas moléculas fluorescentes que marcam especificamente uma IDR, o que significa que elas podem ser monitoradas em misturas complexas, como células vivas¹⁰. Medir dinamicamente a sensibilidade estrutural das IDRs em células vivas é necessário para entender como o ambiente regula a conformação e a função do proteoma desordenado.

FRET é um método poderoso para quantificar a sensibilidade estrutural de IDRs, bem como proteínas globulares e multidomínios em células vivas. O método requer uma construção que consiste em um IDR de interesse prensado entre duas proteínas fluorescentes (FP), conhecido como par FET. Para esse protocolo, sugerimos o uso de mCerulean3 como FP doador e Citrino como PF receptor, devido à sua grande faixa dinâmica, em comparação com outros FPs relatados em estudo anterior sobre sensibilidade das^RRD6. O FRET já foi explorado para medir a sensibilidade estrutural de uma planta IDR em diferentes contextos celulares⁶. Além disso, essa técnica tem sido utilizada para caracterizar as dimensões proteicas globais das IDRs por diferentes grupos de pesquisa, tanto in vitro quanto di ^vivo5,11.

Aqui, descrevemos o método de FRET de conjunto para estudar a sensibilidade estrutural de IDRs em células de levedura viva (Saccharomyces cerevisiae). Mostramos resultados representativos que são baseados em uma planta IDR chamada AtLEA4-5. AtLEA4-5 é desordenado em solução, mas dobra-se em α-hélice quando o apinhamento macromolecular é induzido in vitro¹². O AtLEA4-5 é um bom modelo de referência para esse método por ser relativamente pequeno (158 resíduos), desordenado e sensível a perturbações ambientais, como relatado in silico e in vitro6,12. O método apresentado aqui pode ser dimensionado para abordagens de alto rendimento, pois as células de levedura são fáceis de cultivar, e o tratamento é aplicado em pequenos volumes. Além disso, pequenas modificações no protocolo podem ser aplicadas a outros sistemas celulares, como bactérias e células^vegetais6. O protocolo pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia molecular com acesso a um leitor de microplacas com modo fluorescência, equipamento disponível na maioria das instituições de pesquisa.