Summary
Ett steg-för-steg-protokoll för tillverkning av streptavidinaffinitetsnät tillhandahålls för användning i strukturella studier av utmanande makromolekylära prover med kryoelektronmikroskopi.
Abstract
Streptavidin-affinitetsnät tillhandahåller strategier för att övervinna många vanliga utmaningar med kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) provberedning, inklusive provdenaturering och föredragna orienteringar som kan uppstå på grund av gränsytan mellan luft och vatten. Streptavidin-affinitetsnät används dock för närvarande av få kryo-EM-laboratorier eftersom de inte är kommersiellt tillgängliga och kräver en noggrann tillverkningsprocess. Tvådimensionella streptavidinkristaller odlas på ett biotinylerat lipidmonolager som appliceras direkt på vanliga holey-carbon cryo-EM-rutnät. Interaktionen med hög affinitet mellan streptavidin och biotin möjliggör efterföljande bindning av biotinylerade prover som är skyddade från luft-vattengränssnittet under kryo-EM-provberedning. Dessutom ger dessa rutnät en strategi för att koncentrera prover som finns tillgängliga i begränsade mängder och rena proteinkomplex av intresse direkt på gallren. Här tillhandahålls ett steg-för-steg, optimerat protokoll för robust tillverkning av streptavidinaffinitetsnät för användning i kryo-EM och negativa färgningsexperiment. Dessutom ingår en felsökningsguide för vanliga utmaningar för att göra användningen av streptavidinaffinitetsnät mer tillgänglig för den större kryo-EM-gemenskapen.
Introduction
Elektronkryomikroskopi (cryo-EM) har revolutionerat området strukturbiologi genom att möjliggöra makromolekylär strukturbestämning av stora, flexibla och heterogena prover som tidigare var oåtkomliga med röntgenkristallografi eller kärnmagnetisk resonans1. Denna metod fungerar genom att snabbfrysa makromolekyler i lösning för att skapa ett tunt lager av glasaktig is som sedan kan avbildas med hjälp av ett elektronmikroskop. Under de senaste åren har betydande framsteg inom både mikroskophårdvara och bildbehandlingsprogramvara ytterligare utökat de typer av prover som är lämpliga för högupplöst strukturbestämning med kryo-EM.
Icke desto mindre är beredningen av tunna, förglasade prover fortfarande ett av de mest kritiska stegen i makromolekylär strukturbestämning med kryo-EM. Biologiska prover är ofta dynamiska, ömtåliga, benägna att denatureras och är ibland endast tillgängliga i små mängder för kryo-EM-studier. Under blottingprocessen interagerar dessa partiklar med det hydrofoba gränsytan mellan luft och vatten, vilket kan resultera i partikelföredragna orienteringar, demontering av ömtåliga komplex, partiell eller fullständig denaturering av provet och aggregering 2,3,4. Användning av rengöringsmedel eller andra ytaktiva ämnen, kemisk tvärbindning och adsorption av prover för att stödja lager är vanliga strategier för att bevara biologiska prover under frysningsprocessen. Stödskikt som grafenoxid 5,6,7 eller amorft kol8 fungerar också för att koncentrera partiklar på gallret genom adsorption när provet är tillgängligt i begränsade mängder. Dessa metoder är dock inte generella eller tillförlitliga, och optimering av nätberedning kan vara extremt tidskrävande eller misslyckas helt.
Streptavidin affinitetsnät 9,10 utvecklades för att övervinna dessa brister och för att tillhandahålla en mild och allmänt tillämplig metod för att isolera komplexet av intresse och skydda det från gränsytan mellan luft och vatten. Dessa rutnät använder ett tvådimensionellt (2D) streptavidinkristallgitter odlat på ett monolager av biotinylerade lipider på gallret. Efter att proverna själva har biotinylerats (ofta glest och slumpmässigt, vilket innebär ett biotin per komplex i genomsnitt) kan de appliceras på det streptavidinbelagda gallret. Eftersom provadsorption bygger på den extremt höga affiniteten mellan streptavidin och biotin kan provkoncentrationer så låga som 10 nM användas med dessa galler. Kommersiellt tillgängliga biotinyleringssatser för proteiner och biotinylerade primers för DNA-innehållande komplex gör det relativt enkelt att fästa de nödvändiga biotindelarna på de flesta prover av intresse. Förutom att koncentrera provet och hålla det borta från det skadliga luft-vattengränssnittet under blotting, kan slumpmässig biotinylering av en eller bara några få lysinrester avsevärt förbättra orienteringsområdet för molekylen av intresse på kryo-EM-rutnätet, vilket visats i ett antal studier11. Medan signalen från den underliggande streptavidinkristallen finns i de råa bilderna, kan databehandlingsscheman som involverar Fourierfiltrering av de skarpa Bragg-reflektionerna från kristallen enkelt avlägsnas under tidig databehandling, vilket i slutändan möjliggör högupplösta rekonstruktioner av provet av intresse 11,12,13. Här tillhandahålls ett optimerat, steg-för-steg-protokoll för robust produktion av streptavidinaffinitetsnät och efterföljande användning i kryo-EM-experiment. Det tillhandahållna protokollet förväntas slutföras under en 2-veckorsperiod (figur 1A). De första delarna av protokollet beskriver beredningen av reagenser, förbehandlingen av galler och de första kolindunstningsstegen. Därefter beskrivs instruktioner för beredning av lipidmonoskiktet och tillväxten av streptavidinkristaller på EM-galler. Dessutom ges instruktioner för användning av streptavidinaffinitetsgaller i EM- och kryo-EM-experiment med negativ färgning. Slutligen tillhandahålls procedurer för att ta bort streptavidin-signal från mikrobilder när kryo-EM-data har erhållits.
Protocol
1. Beredning av reagenser
- Späd kommersiellt inköpt streptavidin till en slutlig koncentration på 0,5 mg/ml i kristallisationsbuffert (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10 % trehalos). Se till att den slutliga trehaloskoncentrationen är 10 %. Snabbfrys alikvoter på 25–50 μl i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
- Lös 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(biotinyl)natriumsalt i 65:35:8 v/v/v kloroform/metanol/vattenlösningsmedel för en slutlig fettkoncentration på 1 mg/ml. Förvara alikvoter för engångsbruk på 20–30 μL vid -80 °C i injektionsflaskor av glas.
OBS: Beredning av lösningsmedel är mer exakt om det görs efter vikt. Kombinera först 1,85 g ultrarent vatten med 6,41 g högpresterande metanol av vätskekromatografikvalitet (HPLC) och tillsätt detta till 22,42 g kloroform för att förbereda lösningsmedlet.
VARNING: Läs och förstå tillverkarnas säkerhetsdatablad och rekommenderade instruktioner för hantering och bortskaffande av kloroform och organiska metanollösningsmedel innan du påbörjar detta protokoll. Undvik direktkontakt av metanol med huden.
2. Förbehandling av galler
- Tvätta kolfolie på guldnätsgaller genom att doppa två gånger i 100 % kloroform och en gång i 100 % etanol. Lägg gallren på rent filterpapper för att torka. Upprepa tvättprocessen i totalt tre cykler.
OBS: Reproducerbar framgång har uppnåtts med kommersiellt tillgängliga kolfoliegaller som har en kolfilm med en tjocklek på 10-12 nm kol (se materiallista) med hålstorlekar från 0.6-2 μm. Kommersiellt tillgängliga guldfoliegaller och hemmagjorda håliga kolnät framställda enligt Rubinstein-laboratoriets nanofabrikationsprotokoll14 har också använts framgångsrikt. Mindre reproducerbara resultat har erhållits med kommersiellt tillgängliga galler som har tunnare kolfilmer. Använd inte koppargaller, eftersom koppar reagerar med organiska aminer som kan finnas i provet. - När gallren har torkat, avdunstar ett 2,5-5 nm tjockt lager kol på kolsidan av de håliga kolgallren. Koltjockleken styrs med kvartskristallfilmens tjockleksmätning som är inbyggd i kolförångaren som finns i materialtabellen .
- Låt det nyavdunstade kolet åldras (dvs. bli mer hydrofobt) i 1 vecka.
3. Beredning av streptavidingitter
OBS: För att odla 2D-streptavidinkristaller på EM-rutnäten med håligt kol appliceras först ett biotinylerat lipidmonolager på hålen i kolfilmen (figur 1B) genom Langmuir-Schaefer-överföring. Lipidmonoskiktet bildas efter de efterföljande stegen (figur 2). Talkpulver skapar en gräns mellan ricinoljan och petriskålen, och ett tunt lager ricinolja hjälper till att upprätthålla ett konstant yttryck när lipidmonolagret bildas. Sidan som innehåller det förångade kolet från steg 2.2 används för att plocka upp monoskiktet, överflödiga lipider tvättas bort med kristallisationsbuffert och streptavidinlösning inkuberas på gallret för kristallisation.
- Rengör bänkområdet med 70 % etanol.
- Skölj en 5 μL glasspruta flera gånger med kloroform för att rengöra. Låt sprutan torka helt före användning.
- Tvätta kolförångade galler igen, dvs. strax före användning, genom att doppa dem i 100 % etanol. Låt gallren torka på rent filterpapper.
- Medan gallren torkar, tvätta varje antikapillär pincett med 100 % kloroform och 100 % etanol. Låt pincetten torka helt.
- På den rena sidan av parafilmen, förbered tre 50 μL droppar kristallisationsbuffert (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalos) för varje galler som kommer att göras.
- Fyll locket på en 35 mm obelagd petriskål med kristallisationsbuffert (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalos). Rengör ytan med linspapper.
- Strö talk av vetenskaplig kvalitet runt petriskålens omkrets. Detta fungerar sedan som en indikator, i nästa steg, på hur långt ricinoljan har spridit sig. Tillsätt tillräckligt med talk för att skapa en barriär som skyddar ricinoljan från att vidröra kanten på petriskålen. Att tillsätta för mycket talk begränsar det tillgängliga utrymmet för att göra lipidmonolagret.
- Doppa en 200 μL pipettspets i ricinoljan för att få en medelstor droppe (cirka 20 μL) som hänger från pipettspetsen. Rör denna droppe mot ytan av bufferten i petriskålen, där den kommer att spridas för att bilda en enhetlig film. Den resulterande tunna oljefilmen fungerar som en kolv15, som upprätthåller ett konstant yttryck när ett lipidmonolager bildas (steg 3.10).
OBS: Det är viktigt att tillsätta tillräckligt med ricinolja snarare än för lite, och det är bättre att tillsätta som en enda droppe. Låt ricinoljan sprida sig helt innan du gör lipidmonolagret. - Skölj 5 μl-glassprutan en eller två gånger med den upplösta lipiden innan du tar upp en alikvot för användning. Undvik att skapa luftbubblor i lipiden som fyller sprutan.
OBS: Glassprutan sköljs med upplöst lipid om någon kvarvarande kloroform finns kvar från steg 3.2. Kvarvarande kloroform kan påverka kvaliteten på det resulterande monolagret. - Dosera minsta möjliga volym (~0,5 μL) lipid från sprutan och rör försiktigt den hängande droppen mot ricinoljefilmens yta. Observera att lipidlösningen bryter igenom ricinoljefilmen vid kontaktpunkten och att det resulterande lipidmonoskiktet bildar en cirkel i mitten av den tunna filmen av ricinolja.
- Tillsätt flera droppar lipid sekventiellt eller tillsätt mer lipid efter att ha gjort några rutnät, men om för mycket tillsätts kommer lipiden att spridas förbi ricinoljans gräns och in i omkretsen där talkpulvret och eventuellt förorenande ytaktivt ämne har bundits. Om detta inträffar måste processen startas om.
- Plocka upp ett galler med en antikapillär pincett så att den raka armen på pincetten och den kolavdunstade sidan av gallret båda är vända mot monolagret.
- Överför en del av monoskiktet till det håliga kolet genom att vidröra den kolförångade sidan av gallret till monoskiktet i 1-2 s.
OBS: Lyckad överföring indikeras av att gallrets yta blir hydrofil, vilket gör att ett tunt, sfäriskt lock av buffert täcker hela gallret efter att det har lyfts bort från petriskålen. - Rör vid det sfäriska locket på bufferten som nu fäster vid gallret, sekventiellt i 1 s vardera, till de tre 50 μL dropparna kristallisationsbuffert som förbereddes på parafilm i steg 3.5.
OBS: Detta steg försöker ta bort så mycket som möjligt av överskottet av lipiden, som täcker ytan av det sfäriska locket (snarare än den tidigare hydrofoba kolfilmen), för att undvika bildandet av lipidvesiklar när prover ses i elektronmikroskopet. - Tillsätt försiktigt 4 μl 0,5 mg/ml streptavidin i det återstående sfäriska locket av kristallisationsbufferten på gallret.
- Placera gallret i en fuktkammare. Upprepa steg 3.11-3.14 för hela rutnätssatsen.
- Inkubera gallren vid rumstemperatur (RT) i 2 timmar i en fuktkammare för att undvika avdunstning.
OBS: Det är viktigt att guldsidan av gallret inte blir våt vid något tillfälle efter att monolagret har applicerats. - Efter 2 timmars inkubation bereds en 300 μL droppe sköljbuffert (10 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10 % trehalos) för varje galler på den rena sidan av parafilmen.
OBS: Sköljbufferten innehåller 50 mM KCl snarare än 150 mM KCl, som finns i kristallisationsbufferten som används för steg 3.5-3.6. - Tvätta överskottet av streptavidin genom att placera gallret på en droppe av 300 μL sköljbuffert. Utför steg 3.18-3.20 för ett rutnät i taget. Undvik att lämna gallren på 300 μL sköljbuffertdroppe under längre perioder.
OBS: Endast en tvätt utförs eftersom streptavidinkristallen/monolagret är ömtåligt vid denna tidpunkt. Varje gång ett galler lyfts bort från ytan på en droppe tvättbuffert bryts vätskebryggan mellan gallret och tvättdroppen. Vid tidpunkten för brottet appliceras en transient tryckgradient (sugtryck) på de självbärande monolagerkristallerna som spänner över de öppna hålen i kolfilmen. Detta sugtryck förväntas orsaka övergående dominans av monolagerkristallen, åtföljd av expansion av det område som täcks av kristallerna. Om ökningen av arean överskrider kristallens elastiska gräns kan kristallen spricka eller bli oordnad. - Torka omedelbart den antikapillära pincetten med en luddfri trasa för att underlätta frigöringen av gallret på filterpapper i följande steg. Plocka upp gallret som flyter på droppen av sköljbufferten genom att sticka in den böjda armen på den antikapillära pincetten i droppen.
- Torka försiktigt bort överflödig buffert från sidan med filterpapper. Lägg gallret på filtrerpapper med guldsidan nedåt, upprepa steg 3.18-3.20 för varje galler och låt gallren torka i 15-20 min.
- När gallren är torra, vänd på dem så att guldsidan nu är vänd uppåt. Avdunsta ett tunt lager kol (cirka 0,5-2 nm tjockt) på guldsidan av gallren.
OBS: Förvara galler vid en konstant luftfuktighet, vars värde inte verkar spela någon roll, och notera att flera förändringar i relativ luftfuktighet förväntas resultera i cykler av expansion och sammandragning. Låt gallren åldras i 1 vecka innan kryo-EM används för bästa resultat eftersom hydrofobiciteten på baksidan av gallret kan vara viktig för monolagerstabiliteten. Galler är stabila under långa perioder, men efter 3 månader kan kolet på baksidan bli mindre hydrofobt.
4. Kontroll av streptavidinaffinhaltsgallerbatchkvalitet med negativ fläck
- Förbered två droppar 50 μL och en droppe 100 μL sample buffert (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP) på den rena sidan av parafilmen.
- Ta bort trehalosen och rehydrera streptavidingallren genom att röra vid de två 50 μl-dropparna och låt gallret flyta på 100 μl-droppen av provbufferten i 10 minuter.
OBS: Det är bäst att undvika att använda tvättmedel under rehydreringen och efterföljande provbindande inkubationer. Bufferten kommer att spridas till guldsidan av gallren och begränsa effektiviteten hos tvättar för att ta bort överflödiga prover. - Efter rehydrering, plocka upp gallret med en anti-kapillär pincett så att den böjda armen på anti-kapillärpincetten är i droppen.
- Torka försiktigt bort överflödig buffert från sidan och applicera snabbt 4 μL 75-100 nM sample (valfritt).
OBS: Undvik att låta gallret torka efter återfuktning. - Inkubera provet i en fuktkammare i 1-5 min.
OBS: Koncentration och inkubationstider kommer att vara sample beroende och bör optimeras. Den angivna provkoncentrationen och inkubationstiden föreslås som utgångspunkter. - På den rena sidan av parafilmen, sätt upp fyra droppar på 30 μL vardera av både provbuffert och 1 % uranylformiat (UF) färg.
OBS: Läs och förstå tillverkarnas säkerhetsdatablad och rekommenderade instruktioner för hantering och destruktion av uranylformiat innan du utför detta steg. Uranylformiat är en giftig och radioaktiv förening. Se till att få ett institutionellt förhandsgodkännande för användning av radioaktivt material. - Tvätta bort det obundna provet genom att röra vid var och en av de fyra dropparna provbuffert.
- Färga provet med hjälp av standardprocedurer för negativ färgning med UF. Torka försiktigt bort UF-fläcken från sidan och lämna ett mycket tjockt lager av fläck på gallret. Ytterligare 0,5 μL bets kan appliceras på gallret efter blotting för att göra fläcken tjockare om det behövs. Låt gallret lufttorka.
OBS: Eftersom streptavidingallren är mycket hydrofila, tenderar negativ fläck att bilda en mycket enhetlig film överallt, i motsats till vad som vanligtvis ses vid användning av glödurladdningsbehandlade, kontinuerliga kolgaller. Som ett resultat rekommenderas det att lämna en tjockare film av fläcklösning.
5. Frysning av streptavidinaffinitetsgaller med biotinylerade prover
OBS: Följande procedur är avsedd för en ensidig automatiserad kolv som innehåller en intern blottingsensor (ensidig manuell blotting i andra automatiserade dykapparater är också möjlig)
- Förbered två droppar 50 μL och en droppe 100 μL sample buffert (t.ex. 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP) på den rena sidan av parafilm.
- Rehydrera streptavidingaller genom att röra vid de två 50 μL-dropparna och låt gallret flyta på 100 μL-droppen av provbufferten i 10 min.
- Efter rehydrering, plocka upp gallret med en anti-kapillär pincett så att den böjda armen på anti-kapillärpincetten är i droppen.
- Torka försiktigt bort överflödig buffert från sidan och applicera snabbt 4 μL 75-100 nM sample.
- Inkubera provet i en fuktkammare i 1-5 min.
OBS: Återigen, koncentration och inkubationstider kommer att vara sample beroende och bör optimeras. Den angivna provkoncentrationen och inkubationstiden föreslås som utgångspunkter. För prover med låga koncentrationer kan man inkubera under längre tidsperioder och/eller binda provet till gallren flera gånger. - Förbered två 10 μL droppar frysbuffert (t.ex. 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, 3 % trehalos, 0.01 % NP40) på den rena sidan av parafilm. Efter inkubationen tvättas det obundna provet genom att röra gallret till den första droppen av frysbufferten. Släpp gallret på den andra droppen av frysbufferten.
- Ta snabbt tag i kanten av gallret med pincetten fäst på den ensidiga automatiska kolven. Torka försiktigt bort överflödig buffert och applicera snabbt 4 μL frysbuffert (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3 % trehalos, 0,01 % NP40) på gallret.
- Fäst pincetten på den ensidiga automatiska kolven. De bästa resultaten har uppnåtts med hjälp av en blot-sensor som känner av vätskedroppen på gallret med blottider mellan 4-6 s. Villkoren varierar beroende på vilket prov och vilken buffert som används.
6. Databehandling av kryo-EM-filmer som samlats in från streptavidinaffinitetsnät
Datainsamling på streptavidin-affinitetsrutnät kan utföras som med standardrutnät, och inga speciella mikroskopjusteringar är nödvändiga. Proceduren som beskrivs här tar dock bort streptavidinsignalen först efter rörelsekorrigering av mikrobilden. Därför kan databehandlingssteg som partikelpolering som är beroende av ursprungliga filmrutor inte utföras på ett tillförlitligt sätt. Streptavidinsignalsubtraktionen (krävs för all standardbearbetning nedströms förutom CTF-uppskattning) kräver här Matlab version R2014b eller senare som körs i en Linux-miljö. Signalsubtraktion bygger på streptavidinskiktets kristallina natur, vilket möjliggör toppmaskering och därmed signalborttagning från Fouriertransformen för varje mikrograf.
- Ställa in bearbetningsskript
- Kopiera alla filer från kompletterande filer till en dedikerad mapp i projektkatalogen
- Förbered en katalog med namnet processing_scripts som innehåller följande filer:
lsub.m (Kompletterande kodningsfil 1; subtraktionsskriptet)
process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; wrapper-skript som loopar över alla tillgängliga mikrografer, skapar parallella jobb och håller reda på indata och utdata)
process_subtraction.cfg (Supplemental Coding File 3; konfigurationsfil som innehåller parametrarna för subtraktionsjobbet, se 6.2) - Förbered en katalog med namnet support_scripts som innehåller följande filer:
bg_drill_hole.m (Kompletterande kodningsfil 4)
bg_FastSubtract_standard.m (Kompletterande kodningsfil 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (Kompletterande kodningsfil 6)
bg_push_by_rot.m (Kompletterande kodningsfil 7)
ReadMRC.m (kompletterande kodningsfil 8)
WriteMRC.m (kompletterande kodningsfil 9)
WriteMRCHeader.m (kompletterande kodningsfil 10)
- Justera konfigurationsfilen efter behov (process_subtraction.cfg, (se bild 3) efter behov:
- Indata: Sökväg till katalogen som innehåller de rörelsekorrigerade mikrograferna i mrc-format. Använd antingen en katalog eller ett mönster med jokertecken (?, *).
Exempel:
input="/sökväg/till/project_directory/mikrografer/"
eller
input="/sökväg/till/project_directory/mikrografer/*.mrc" - output_dir: Sökväg till den katalog som de gittersubtraherade mikrograferna ska skrivas till.
- only_do_unfinished: Ange (sant|falskt) om redan existerande subtraherade mikrobilder ska skrivas över eller hoppas över. Den här parametern är användbar för att starta gittersubtraktionsskriptet mitt i en mikroskopsession (standard: true).
- num_parallel_jobs: Ange antalet parallella jobb. Det här antalet beror på maskinvaruspecifikationerna som används för bearbetning och bör inte vara högre än antalet tillgängliga kärnor. På system med 32 kärnor och ett nätverksfilsystem uppnåddes optimal prestanda med 14 parallella jobb. För bästa prestanda optimerar du det här värdet med en delmängd av mikrografer.
- Pad_Origin_X: 200 för en K3-detektor i stående orientering (bildbredd < bildhöjd) eller vid användning av en kvadratdetektor (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 för en K3-detektor i liggande orientering (bildbredd > bildhöjd). FFT utförs i fyrkantiga lådor och stoppning krävs om detektorn har icke-kvadratiska dimensioner.
- Pad_Origin_Y: 1000 för en K3-detektor i stående orientering (bildbredd < bildhöjd), 200 vid användning av en kvadratdetektor (Falcon III, Falcon IV, K2) eller vid användning av en K3-detektor i liggande orientering (bildbredd > bildhöjd).
- Ändra inte Inside_Radius_Ang (90) och Outside_Radius_Ang (3.0). Gittersubtraktionen utförs mellan två upplösningar (enheten är i ångström).
- Pixel_Ang: Ange pixelstorleken som ett flyttalsvärde.
- Tröskel: Subtraktionströskelns gränsvärde för att ersätta gittret med bakgrunden i Fourierrummet. Värden som används är mellan 1,4 och 1,6. Använd 1,42 som utgångspunkt.
- Ändra inte expand_pixel (10) och pad_out_opt (0). expand_pixel är ett diametervärde som används för att maskera runt pixlar med värden som är högre än tröskelvärdet. pad_out_opt är ett alternativ som avgör om ett vadderat område ska inkluderas i utdata.
- addpath_m: Sökväg till supportskripten.
- path_to_matlab_bin: Sökväg till systemets Matlab-installationskatalog.
- path_matlab_script: Sökväg till matlab-subtraktionsskriptet (lsub.m ) som har kopierats ovan under steg 6.1.2.
- Indata: Sökväg till katalogen som innehåller de rörelsekorrigerade mikrograferna i mrc-format. Använd antingen en katalog eller ett mönster med jokertecken (?, *).
- När du har sparat det modifierade skriptet, kör skriptet (bash ./process_subtraction.sh ) för att subtrahera streptavidinsignalen från ingångsmikrograferna. Skriptet kan avbrytas och/eller startas om om parametern only_do_unfinished är inställd på true (se i steg 6.2.3). Om ett fel inträffar granskar du de parametrar som anges i bash-skriptet. Se till att det inte finns några oavsiktliga blanksteg mellan parametervariabler och deras tilldelade värden, eftersom detta är en vanlig felkälla.
- Använd de gittersubtraherade bilderna för vanlig kryo-EM-bildbehandling.
Representative Results
Efter kolavdunstningen i steg 3.21 (vanligtvis efter en vecka) kan streptavidinaffinitetsgaller användas för kryo-EM eller beredning av negativ färgning enligt procedurerna som beskrivs i steg 4 och 5. En representativ mikrobild fångad med en K3-detektor på en titan Krios vid 81 000X förstoring med en pixelstorlek på 1,05 Å av ett biotinylerat prov fryst med streptavidinaffinitetsgaller visas i figur 4A. Lyckad gitterbildning observeras av det kontinuerliga rutnätsmönstret som visas i bildens bakgrund. Detta kan lättare observeras av diffraktionsmönstret som visas i den snabba Fouriertransformen (FFT) som visas i figur 4A (höger). Efter datainsamling, enligt proceduren som beskrivs i steg 6 i detta protokoll, kan signalen som bidrar till bilden av streptavidingittret maskeras beräkningsmässigt för att producera en subtraherad mikrobild (figur 4B) som kan användas för efterföljande databehandlingssteg. FFT i figur 4B (höger) visar att diffraktionsmönstret som observerats i figur 4A (höger) har tagits bort från originalbilden.
Figur 4C visar ett exempel på en mikrobild tagen med ett Tecnai 12-mikroskop vid en förstoring på 49 000x med en pixelstorlek på 1,6 Å av ett biotinylerat prov bundet till streptavidinaffinitetsgaller och negativt färgat med uranylformiat. Galler förbereddes enligt proceduren som beskrivs i steg 4 i detta protokoll, vilket lämnade en tjockare fläckfilm.
Det finns flera vanliga observationer när streptavidingallertillverkningsproceduren misslyckas som beskrivs vidare i diskussionsavsnittet och tabell 1. Figur 5 visar flera exempel på dessa observationer. Figur 5A visar en mikrobild av ett negativt färgat streptavidinaffinitetsrutnät som används från en sats som är mer än sex månader gammal. Monolagret har mobiliserats från hålen i kolfolien i quantifoil-gallren och observeras med liknande dimensioner som hålen i gallret. Figur 5B visar ett exempel på streptavidinkristaller som har hög mosaicitet som lätt störs under provberedningsprocedurer. Figur 5C visar en representativ mikrobild från ett streptavidinaffinitetsrutnät där kolavdunstningen i steg 3.21 är för tunn eller utelämnad. Streptavidingittret har fragmenterats under kryo-EM-provberedningsprocessen. Figur 5D visar ett negativt färgat streptavidinaffinitetsgaller som har kontaminering från lipidvesiklar, troligen på grund av otillräckliga tvättar under steg 3.13 eller att guldsidan av gallret blev våt under steg 3.13-3.20. Se diskussionsavsnittet och tabell 1 för strategier för att lösa dessa vanliga problem.
Figur 1: Schematisk bild av tillverkningsproceduren för streptavidinaffinitetsgaller. (A) Översiktlig tidslinje för tillverkningsproceduren för streptavidinaffinitetsgaller. Hela proceduren kan slutföras under två veckor, vilket kräver två kolavdunstningssteg och en vecka efter varje för att låta kolet åldras tillräckligt. (B) Inzoomad vy av en rutnätsruta i ett streptavidinaffinitetsrutnät som visar de lager som utgör rutnätet efter avslutad tillverkningsprocess, inklusive det vanliga kryo-EM-rutnätet med guldtackor och hålig kolfilm, det första förångade kolskiktet, lipidmonolager, 2D-streptavidinkristall och det bakre stödskiktet för förångat kol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Lipidmonolager och streptavidinkristallisation (A) Bilder som visar hur man framgångsrikt bildar lipidmonoskiktet i den lilla petriskålen med hjälp av talk för att skapa en gräns för ricinoljan som skapar konstant yttryck samtidigt som lipidmonolagret bildas. (B) Bilder som visar hur man odlar streptavidinkristaller på kryo-EM-galler. Först vidrörs kolsidan av gallren till lipidmonoskiktet och följs av tre på varandra följande tvättar i kristallisationsbufferten. Streptavidin tillsätts och gallren inkuberas i en fuktkammare i 2 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempelparametrar för filen process_subtraction.cfg för att utföra streptavidingittersubtraktion från mikrografer (steg 6). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av framgångsrik tillverkning av streptavidinaffinitetsgaller. (A) Kryo-EM-mikrobild av biotinylerade protein/nukleosomkomplex framställda med hemmagjorda streptavidinaffinitetsgaller. FFT visas till höger och visar streptavidinkristalldiffraktionsmönstret. (B) Samma mikrobild som i panel A visas efter gittersubtraktionsproceduren för att ta bort signalen från 2D-streptavidinkristallen från originalbilden. (C) Ett exempel på en mikrobild erhållen genom negativ färgning av ett biotinylerat prov bundet till streptavidin-affinitetsgaller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa resultat av misslyckad tillverkning av streptavidinaffinitetsgaller. (A) Mikrograf som visar mobiliseringen av streptavidinmonolagret från gallerhålen när gallren är äldre än sex månader. (B) Mikrobild som visar streptavidingitter med hög mosaicitet som lätt skadas under både kryo-EM och provberedning med negativ färgning. (C) Mikrobild som visar fragmentering av streptavidingittret under kryo-EM-provberedning när kolavdunstningsskiktet i steg 3.21 är för tunt eller utelämnat. (D) Representativ mikrobild som är kontaminerad med lipidvesiklar troligen på grund av otillräcklig tvättning under steg 3.13 eller på grund av att guldsidan av gallret blir våt under steg 3.13-3.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Felsökningsguide för att övervinna vanliga utmaningar som uppstår under misslyckad tillverkning av streptavidinaffinitetsnät. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande kodningsfil 1: lsub.m Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: process_subtration.sh Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 3: process_subtraction.cfg Klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande kodningsfil 4: bg_drill_hole.m Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 5: bg_FastSubtract_standard.m Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 7: bg_push_by_rot.m Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 8: ReadMRC.m Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 9: WriteMRC.m Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 10: WriteMRCHeader.m Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Vårt protokoll beskriver hur man skapar och använder streptavidin-affinitetsnät och hur man bearbetar data som innehåller streptavidindiffraktionssignalen. Det finns flera kritiska steg i protokollet som kräver särskild uppmärksamhet.
Misslyckade rutnätsbatchar kan spåras tillbaka till flera vanliga fel. Den vanligaste felkällan kommer från användning av föråldrade reagenser eller reagenser av dålig kvalitet. Det är särskilt viktigt att bereda den biotinylerade lipidlösningen exakt enligt beskrivningen i protokollet. Vidare kan eventuella föroreningar, såsom tvättmedelsrester på laboratorieutrustningen eller naturligt närvarande oljor på huden, påverka kvaliteten på streptavidinkristallerna och därmed kvaliteten på de resulterande bilderna. Det rekommenderas därför att utföra tre tvättcykler för gallren före den första kolindunstningen för att avlägsna eventuell kontaminering av ytaktiva ämnen från nättillverkaren (steg 2.1). Dessutom har kontaminering eller förorening av ricinoljan observerats hindra kristallbildning på gallret.
Att tillverka och plocka upp lipidmonolagret är en uppgift som bör övas några gånger för att få en känsla för de små lipidvolymerna. Det är inte ovanligt att detta steg misslyckas de första två eller tre gångerna innan ett adekvat lipidmonolager kan produceras, vilket i slutändan återspeglas i kvaliteten på streptavidinkristaller som ses i negativt färgade galler (Figur 4C).
Det är viktigt att aldrig låta gallrets baksida (guldsidan, lipidsidan) bli blöt under gallertillverkningsprocessen (steg 3.12-3.20). Om baksidan blir blöt rekommenderas att du kasserar gallret. Detta kan resultera i uppkomsten av stora lipidvesiklar som stör bildkvaliteten (Figur 5D) (Rad 3, Tabell 1). Lipidvesiklar kan också observeras på grund av otillräcklig tvättning efter att lipidmonolagret applicerats (steg 3.13). Tre efterföljande tvättar med kristallisationsbuffert rekommenderas efter beröring av lipidmonolagret innan streptavidin tillsätts.
Efter att ett tunt lager kol har avdunstat på trehalosinbäddade galler kan baksidan av gallret blötas utan att gitterkvaliteten skadas. Till exempel observeras ofta vätning av baksidan när provbufferten innehåller även minimala mängder tvättmedel. Vätning av baksidan av provet kan resultera i ospecifik bindning av prover till den tunna kolfilmen på baksidan, vilket minskar effektiviteten för att förhindra partiklar från att diffundera till luft-vattengränssnittet eller användningen av affinitetsbindning för reningsstrategier på nätet. Om möjligt, lägg provet på gallret i frånvaro av tvättmedel. Tvättmedel och andra tillsatser kan tillsättas i efterhand under gallertvättstegen eller tillsättas i ett sista steg före förglasning. Detta är en begränsning för användningen av streptavidin-affinitetsnät; Men om målet är att förbättra preferensorienteringen har provberedning med buffertar, inklusive tvättmedel, utförts framgångsrikt11.
En vanlig felkälla kan härledas till nätens ålder i förhållande till de båda kolindunstningsstegen (steg 2.3 och steg 3.21). I detta protokoll är den rekommenderade väntetiden 5-7 dagar efter kolavdunstningen på baksidan innan man använder streptavidingaller för kryo-EM. När galler används för tidigt efter tillverkningen har gitter- och lipidmonolagret observerats mobilisera ut ur gallerhålen. En liknande iakttagelse kan göras när rutnäten är för gamla och används efter sex månader (figur 5A) (rad 1, tabell 1). Vår hypotes är att denna observation förklaras av förändringar i hydrofobiciteten hos kolbäraren som appliceras för att stabilisera lipidmonolagret och streptavidinkristallerna. Dessutom kan streptavidingitter se mosaikfärgade ut (figur 5B) (rad 3, tabell 1) och brytas i både negativ färgning och kryo-EM om monolagret appliceras på galler där det första kolavdunstningsskiktet (steg 2.3) inte har åldrats tillräckligt.
En annan vanlig felkälla kan spåras till bräckligheten hos det kristallina streptavidinmonolagret (lipidmonolagret är i sig flytande och kan reversibelt expandera eller komprimeras). Kolavdunstningen på baksidan (steg 3.21) ger kritisk stabilitet till både monolagret och streptavidingittret under provadsorptionen, tvättningen och kryo-EM-blottningsprocessen. I avsaknad av tillräcklig kolavdunstning till gallrets baksida kommer streptavidingitter ofta att verka fragmenterade efter blotting/frysning (figur 5C) (rad 2, tabell 1). I detta protokoll föreslår vi att du använder en ensidig automatiserad frys för enkelsidig blotting. Denna metod ger mycket reproducerbara blottingförhållanden som bevarar streptavidingittret under frysningsprocessen och möjliggör strömlinjeformad optimering av provapplicerings- och blottingparametrarna. Alternativt har andra automatiska djupfrysningsapparater använts i kombination med manuell blotting. För att göra detta är den faktiska blotting-funktionen inaktiverad i enhetsinställningarna, och rutnätet torkas istället genom att sträcka sig med en pincett som håller läskpapper genom sidoingången. Denna metod kan uppnå högkvalitativa resultat för laboratorier utan en ensidig blotting och plunge freeze-anordning; Reproducerbarhet från nät till nät är dock utmanande.
Även om det finns många fördelar med att använda streptavidin-affinitetsnät, måste vissa begränsningar av denna metod beaktas. På grund av ingreppets karaktär är det vanligtvis inte möjligt att bedöma kvaliteten på streptavidingittret förrän hela processen har slutförts. Det rekommenderas att snabbt screena kvaliteten på varje sats med negativ fläck innan prover fryses. På grund av den signal som streptavidingittret bidrar med till de råa bilderna kan det i vissa fall vara svårt att bedöma, enbart utifrån bilderna, om det finns ett tillräckligt antal intakta, spridda partiklar. Av samma anledning är on-the-fly-bearbetning av cryo-EM-data under datainsamling inte möjlig om inte streptavidinsignalsubtraktionsproceduren har inkluderats i dataförbehandlingspipelinen. Eftersom streptavidinsignalen vanligtvis subtraheras från de rörelsekorrigerade bilderna och inte själva bildrutorna, kan Bayesiansk polering, som implementeras i populära programvarusviter, misslyckas när man använder subtraktionsprocedurerna som beskrivs. Det rekommenderas därför att utföra rörelsekorrigering i flera patchar för att minimera partikelrörelser från början av databehandlingen16.
Trots dessa begränsningar erbjuder streptavidin-affinitetsnät många fördelar. Två stora fördelar som streptavidin-affinitetsgaller ger jämfört med vanliga kryo-EM-galler med öppna hål är ett sätt att skydda prover från luft-vattengränssnittet och koncentrera prover med låg förekomst (10-100 nM) på gallret. Andra stödlager, såsom kol och grafenoxid, kan också användas som strategier för att övervinna dessa flaskhalsar i provberedningen. I ett exempel var streptavidinaffinitetsnät den enda lösningen för att erhålla en intakt rekonstruktion av en protein-nukleinsyrainteraktion som var oförenlig med tvärbindningsmetoder. 12
En annan stor fördel som streptavidin-affinitetsnät ger är en lösning på prover som adsorberar till andra stödlager, såsom kol eller grafenoxid, med föredragna orienteringar som hindrar möjligheten att få en 3D-rekonstruktion av provet av intresse. Slumpmässig biotinylering av prover med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit gör det möjligt att slumpmässigt fästa provet av intresse till streptavidinmonolagret för att få fler potentiella vyer för att övervinna denna utmaning.
Dessutom erbjuder streptavidin-affinitetsnät fördelar som är unika för affinitetsbaserade rutnät. Den höga affiniteten och specificiteten hos streptavidin-biotininteraktionen gör det möjligt att koppla ihop streptavidin-affinitetsrutnät med andra arbetsflöden som involverar biotin för att rena komplex av intresse. I ett publicerat exempel immobiliserade författarna ett komplex på streptavidinaffinitetsgaller och inkuberade en bindningspartner med okänd stökiometri i stort överskott. Efter att ha tvättat bort eventuellt obundet protein erhölls det korrekt sammansatta superkomplexet och kunde omedelbart analyseras med kryo-EM11. En möjlig framtida tillämpning kan vara att kombinera streptavidinbindande proteintaggar, Avi-tag-systemet eller närhetsmärkningsmetoder med streptavidinaffinitetsnät för att extrahera enskilda proteiner och/eller proteinkomplex direkt från rekombinanta eller endogena källor utan standardiserade avancerade reningsscheman.
Genom att tillhandahålla detta protokoll bör laboratorier enkelt kunna reproducera tillverkningen av streptavidinaffinitetsnät och etablera dem som ett mer allmänt använt verktyg för strukturell analys av proteinkomplex med kryo-EM.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
T.C. stöddes av National Institute of General Medical Sciences utbildningsbidrag för molekylär biofysik GM-08295 och National Science Foundation forskarstipendium under bidragsnummer DGE 2146752. R.G. och B.H. stöddes av National Institute of Healths anslag R21-GM135666 som tilldelats R.G. och B.H. Detta arbete finansierades delvis genom anslaget R35-GM127018 från National Institute of General Medical Sciences till E.N. E.N. är utredare vid Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
