複雑な3D多孔質媒体の運動性と増殖を研究するための3Dプリンティングバクテリア

粒状ハイドロゲルマトリックスを備えた3Dバイオプリンターを使用すると、バイオプリンターの機能を拡張して、細菌のコロニーを、平らな基板に印刷すると、細菌懸濁液の粘度が低いためにスランプする形状に印刷できます。ここで紹介するアプローチの分解能は、押し出し速度、ニードルのサイズ、プリントヘッドの速度、ニードル内の空気、およびバクテリア懸濁液の粘度によって異なります。細菌懸濁液の量が少ないため、細菌懸濁液をシリンジと針に装填する際に気泡が不注意に導入される可能性があります。これにより、最終的な印刷構造に気泡が堆積する可能性があります(図4)。気泡がプリントに導入される別の方法は、プリント前にプランジャーを押し下げて針の先端に細菌懸濁液の小さな滴を形成せず、針の先端にエアギャップが存在する場合です。また、プリント前にシリンジプランジャーを押し下げないと、同じバッチでプリントされる細胞の量が異なる可能性があります。しかし、時間が経つにつれて、 図4に示すように、気泡は周囲の媒体に溶解します。 押出ステップを較正する場合、堆積物量は、プリントヘッドのリニアアクチュエーターがシリンジプランジャーをどのように移動するかに依存し、シリンジの内径は体積に直接影響します。さらに、バクテリア懸濁液のレオロジー特性は、ニードルの収縮によってせん断しやすさに影響を与え、スムーズに印刷します。したがって、この校正手順は、シリンジ/ニードル/細菌懸濁液のセットアップごとにやり直す必要があります。原則として、シリンジのキャリブレーションは自動化できます。しかし、実際には、多くのユースケースに広く適用されるようなコードを記述することは困難です。例えば、1 mLのシリンジから約300 μLの押し出しを校正するユーザーは、目標容量30 μLで校正するユーザーよりもはるかに頻繁にシリンジを再装填する必要があります。キャリブレーションプロセスの開始時にEステップから体積へのキャリブレーションの定数が不明であるため、ユーザーは実際にリロードが必要な頻度を正確に予測できない場合があります。さらに、キャリブレーションプロセスを自動化するには、事前に計量された各1.5 mLチューブの正確な位置を指定する必要があります。すべてのバイオインクがニードルからチューブに堆積し、正確なキャリブレーションを行うには、ニードルとチューブの底面/壁の間に正確な接触を行う必要があります。接触が良好でないと、小さな液滴が濡れたまま針に付着する可能性があります。したがって、チューブ間の位置のばらつきは、校正プロセスの誤差に大きく寄与する可能性があります。これらの理由から、著者らは、各ユーザーが独自のニーズに合ったキャリブレーションプログラムを構築することを推奨しています。 今回紹介したアプローチの大きな特徴は、細菌が環境中に広がる様子を、運動性や増殖性を介してイメージングで直接可視化できることです。イメージング用のプロトコルの以前のバージョンでは、6ウェルプレートに19 mLの顆粒状ハイドロゲルマトリックスを充填していました。しかし、倒立顕微鏡で観察できる細胞の水平線の3Dプリントに成功したとしても、培地の上面にも高密度のコロニーが成長し、明視野顕微鏡による可視化が制限されます(図5)。上面のコロニーは、印刷中にシリンジ針を培地に挿入したり、培地から取り除いたりした際の汚染が原因である可能性があります。この問題を回避するために、細胞の垂直線をシンチレーションバイアルに印刷します(図6A)。しかし、円筒形のバイアルの曲率により、イメージング中に歪みが発生しました。そのため、印刷用のサンプル容器として平壁キュベットと組織培養フラスコを選択し、歪みのないイメージングを可能にしました(図6B-D)。組織培養フラスコの限界の1つは、首が小さく傾いているため、プリントできる形状が制限されることです。 まとめると、このプロトコルは、複雑な多孔質環境での細菌の運動性と成長を長期間にわたって観察することを可能にします。図6B-Gには、明視野顕微鏡を用いたバイオフィルム形成コレラ菌や、レーザー走査型蛍光共焦点顕微鏡を用いた大腸菌のプランクトン細胞の例が示されており、このアプローチの汎用性が実証されています。実際、ハイドロゲルマトリックスの潜在的な問題は、蛍光顕微鏡で画像化した場合に自家蛍光を発する可能性があることです。しかし、図6F,Gに示す画像は、ここに示した実験プラットフォームでは、そのような自家蛍光が最小限であることを示しています。このような光学顕微鏡アプローチのもう一つの限界は、~100秒ナノメートルの回折限界によって設定される空間分解能です。しかし、この長さスケールは個々の細菌細胞のサイズよりもはるかに小さいため、光学技術により、個々の細胞のスケール(図6G)からより大きな多細胞コロニーのスケールまで細菌細胞を画像化する機能が提供されます30,31,32,33。その他の例を以下に説明します。 上述したように、ここで紹介したアプローチは、小容量(1 mL)および大容量(20 mL)のマトリックスで細菌コロニーを3Dプリントおよびイメージングするために使用できます。したがって、運動性および非運動性の コレラ菌 の3Dプリントコロニーを代表例として、異なるボリュームを使用して得られた結果の違いを以下に説明します。印刷物の空間分解能(線の幅)は、ノズルの内径によって設定されます。以下に説明する例では、内径が0.6mmの針は、0.6mmの初期円筒コロニーをもたらす。以前の研究では、内径が~100-200μmのプルガラスキャピラリーを使用することで、印刷解像度をさらに低下させることができることが実証されています33。 小容量の場合、2つの異なる細孔径分布を有する2つの異なる顆粒ハイドロゲルマトリックスが使用される:1つは、コレラ菌細胞の平均直径よりも大きい平均細孔径、0.2〜0.4μm36、およびもう1つは、この直径よりも小さい平均細孔径を有する。12日間にわたるサンプルは、コロニーの経時的な面拡大の画像分析によって画像化され、測定されます(図7および図8)。細胞増殖によってのみ周囲に広がる非運動性細胞については、調査した異なるマトリックス間で面膨張率が類似しており(図7)、マトリックス孔径の違いは、予想どおり、成長による細胞拡散に影響を与えないことが示されました。対照的に、活発な運動性によって周囲に広がる運動性細胞では、ヒドロゲル粒子による閉じ込めが細胞運動性を妨げにくい、孔の大きいヒドロゲルマトリックスの方がコレラ菌の面拡大速度が高かった。細菌の拡散におけるこれらの違いは、コロニーの形態にも明らかでした(図8)。より大きな細孔を持つヒドロゲルマトリックス中のコレラ菌のコロニーは、滑らかで拡散したプルームを通して広がり(図8A)、以前に観察されたように活発な運動性を介して広がることを反映している32。実際、この解釈と一致して、これらの拡散プルームは非運動性細胞の場合には観察されません(図8C)。さらに、細孔は十分に大きいため、細胞が細孔を泳ぐときにビーズを押し出すことはありません。さらに、遊泳によって加えられる粘性応力は1Pa未満であり、周囲のハイドロゲルマトリックスを著しく変形させるには不十分です。対照的に、細孔の小さいハイドロゲルマトリックスのコロニーは、運動性細胞と非運動性細胞の両方で、粗いフラクタル状のプルームを介してのみ広がり(図8B、D)、細胞増殖のみによる広がりを反映していますが、細胞は成長し、一過性に変形して周囲のマトリックスを生成します。実際、ハイドロゲルマトリックスの降伏応力が細胞の膨圧よりもはるかに小さいことを考えると、この小さな孔径の限界では、マトリックスは細胞増殖に対して弱い抵抗性しか提供せず、以前の研究でも検証されたように、3Dプリントされた構造に強く影響しないようです37。 同様の結果は、大量のサンプルで行われた実験でも観察されます。しかし、これらのサンプルには栄養素が豊富に含まれているため、この実験はより長い時間スケールで細胞の成長を維持できる可能性があります。一例として、平均細孔径が細胞径よりも小さい粒状ハイドロゲルマトリックスを用いた結果が示されており、細胞の広がりは主に増殖によるものであった。サンプルは、顆粒状ハイドロゲルマトリックスで~30日間画像化され、最初の150時間、非運動性細胞と運動性細胞の両方で同様の面拡張が観察されました。ただし、さらに長い時間では、サンプル間で強いばらつきが観察され、一部のサンプルはより速い拡散速度を示します(図9 および 図10)。興味深いことに、実験後にハイドロゲルマトリックスをリサンプリングすると(ハイドロゲルマトリックスの体積が大きいため)、降伏応力、貯蔵弾性率、損失弾性率の減少が測定され(図11)、マトリックスが軟らかくなったことが示されました。この変化は、 コレラ菌 がヒドロゲルマトリックスの特性を変化させ、細胞の拡散を長時間促進する分子を産生していることが原因である可能性があり、今後の研究で検証する興味深いものとなるでしょう。これらの実験の結果となる粗いフラクタル状のコロニー形態の例を 図10に示します。 図1:特注3Dバイオプリンターの画像。 (A)使い捨てのルアーロックシリンジとニードルを備えた改良型シリンジポンプ押出機ヘッドを備えたバイオプリンター。バイオプリンターの幅は~46cmです。(B)詰まったハイドロゲルマトリックスで満たされたフラスコ内の細胞の3Dプリントの画像。画像の幅は87mmです。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 図2:粒状ハイドロゲルマトリックスのレオロジー特性の特性評価。 (A)加えられたせん断速度の関数としてのせん断応力。(B)発振周波数の関数としての貯蔵弾性と損失係数、 それぞれG’ と G”。凡例は、各ヒドロゲルマトリックスの調製に使用されたヒドロゲルの質量分率を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:2つの代表的な顆粒状ハイドロゲルマトリックスの細孔径測定。 トレーサーを追跡することにより、特徴的な細孔寸法の分布が各ハイドロゲルマトリックスについて決定されます。データは 1-CDF で表され、CDF は累積分布関数です。凡例は、各マトリックスの調製に使用したヒドロゲルの質量分率を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:バクテリアの3Dプリント中に形成される気泡の例。 (A)イメージングセットアップの概略図。(B)LBで膨潤した1.2%ハイドロゲルマトリックス中のプリント(赤枠)の下部に気泡があるコ レラ菌 の増殖のスナップショット。37°Cで59時間増殖すると、気泡は完全に溶解し、ヒドロゲルマトリックスの弾力性によりコロニーが崩壊します。スケールバー = 2 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図5:LBで膨潤した1.2%ハイドロゲルマトリックスと、37°Cで48時間のインキュベーション後に上面に形成されたバイオフィルムを充填した6ウェルプレートにプリントした運動性コレラ菌の水平線の画像。 (A)イメージングセットアップの概略図。(B)3Dプリンティング時のコンタミネーションによる上面のバイオフィルム形成により、不透明度が低下し、水平線の鮮明なイメージングができなくなります。上面は、おそらく成長の違いによるしわを形成します。スケールバー = 5 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図6:このメソッドで使用できるさまざまなサンプル容器の例。(A)470時間後に1.2%顆粒状ヒドロゲルマトリックスを充填したガラスバイアルに印刷したコレラ菌。バイアルの湾曲により、成長のイメージングが困難になります。スケールバー = 5 mm。 (B) 1.2%顆粒状ハイドロゲルマトリックスを充填したマイクロキュベットにプリントした コレラ菌 。平坦な面は鮮明なイメージングを可能にしますが、容量が小さいため、細胞が増殖基質を使い果たすまでの実験時間が制限されます。(C)1.2%顆粒状ハイドロゲルマトリックスを充填した組織培養フラスコでプリントした コレラ菌 を画像化するためのズームレンズによるイメージングセットアップ。マイクロキュベットケースと同様に、平らな側面により鮮明なイメージングが可能です。組織培養フラスコには、大量の顆粒状ハイドロゲルマトリックスを充填できるため、実験期間が長くなります。(D)37°Cで100時間インキュベートした後、1.2%顆粒状ヒドロゲルマトリックス内にプリントした コレラ菌 のズームレンズからの画像。 スケールバー = 1 mm。 (E) 蛍光細胞をイメージングするための共焦点顕微鏡によるイメージングセットアップ。(F)37°Cで10日間インキュベートした後の1.2%顆粒ハイドロゲルマトリックス内の蛍光 大腸菌 の共焦点顕微鏡写真の3D投影。 スケールバー = 50 μm。 (G)ハイドロゲルマトリックス内の蛍光 大腸菌 の単一細胞分解能共焦点顕微鏡写真。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図7:1 mLの顆粒状ハイドロゲル支持体マトリックスに印刷した コレラ菌 のコロニーの時間の関数としての面積拡大。 プロット上のデータは、 図8の画像解析によるものです。運動性細胞(閉じた赤い丸と四角)は、非運動性細胞よりも速い速度で広がることが観察され、成長と運動性の両方による広がりを反映しています。さらに、孔径の大きいハイドロゲルマトリックス中の運動性細胞(赤い四角)は、0.3 μmの細孔を持つハイドロゲルマトリックス中の細胞(赤丸)よりも速い速度で広がりました。非運動性細胞は、成長しているだけなので、2つの細孔サイズ間で面膨張率に違いはありません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図8:1 mLの顆粒状ヒドロゲル支持体マトリックスにプリントした コレラ菌 のコロニー。 (A)細孔径が平均細胞径よりも大きい0.9%顆粒状ハイドロゲルマトリックスにおける運動性 コレラ菌 の成長と運動性のスナップショット。矢印は、細胞がハイドロゲルマトリックス内を移動することによって形成される拡散プルームを示しています。(B)細孔径が平均細胞径より小さい1.2%顆粒ハイドロゲルマトリックスにおける運動性 コレラ菌 の成長と運動性のスナップショット。矢印は、細胞の成長によって形成される粗いフラクタル状のプルームを示しています。(C)細孔径が平均細胞径よりも大きい0.9%顆粒ハイドロゲルマトリックスにおける非運動性 コレラ菌 の時間進化のスナップショット。この場合、運動性を反映した拡散プルームは観測できない。(D)細孔径が平均細胞径より小さい1.2%顆粒状ヒドロゲル支持体マトリックスにおける非運動性 コレラ菌 の増殖のスナップショット。この場合、成長を反映した粗いフラクタル状のプルームが再び観察されます。スケールバー = 1 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図9:20 mLの1.2%顆粒ヒドロゲル支持体マトリックスにプリントした コレラ菌 のコロニーの時間の関数としての面積拡大。 非運動性細胞(開いた円)と運動性細胞(閉じた円)は、最初の100時間で同様の速度で広がることが観察されます。100時間後には、面膨張率の違いが観察されますが、これは長時間の変動の進化によるものと考えられます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図10:37°Cで増殖させた22 mLの1.2%顆粒ハイドロゲルマトリックスにプリントした コレラ菌 のコロニー。 (上)運動性 コレラ菌の生育スナップショット。(下)非運動性 コレラ菌の成長のスナップショット。どちらの場合も、成長を反映した粗いフラクタル状のプルームが観察されます。スケールバー = 2 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図11:実験前(0時間)および実験後(397時間)の1.2%粒状ハイドロゲルマトリックスのレオロジー特性の特性評価。 (A)加えられたせん断速度の関数としてのせん断応力。(B)蓄積弾性率と損失弾性率、 それぞれG’と G”、印加振動周波数の関数として。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 Gcodeコマンド 用事 M82の 絶対押し出しモード M302 S0の 冷間押出を有効にする M92 E14575 押し出しステップ/mmの設定 G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 z軸と押し出し位置をゼロに設定し、x、y-位置を35.71mmとy88mmに設定します。 M221 S100 T0の 流量を100%に設定します M107の ファンをオフにします G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 20 μL のバイオインクを、現在位置を設定した 50 μL/分の供給速度でマトリックスに押し出します G0 F200 Z60 ニードルをマトリックスから引き出し、200 mm/minの速度でコンティアナをサンプリングします G0 F500 X65.81 Y81.0 ニードルを500 mm/minの速度で次のサンプルコンティアイナーに移動します G0 F100 Z0 針を次のサンプルコンティアイナーに下げ、100 mm/minの速度で印刷を開始したのと同じz位置にします。 G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 20 μL のバイオインクを、現在位置を設定した 50 μL/分の供給速度でマトリックスに押し出します G0 F200 Z60 ニードルをマトリックスから引き出し、200 mm/minの速度でコンティアナをサンプリングします G0 F500 X96.01 Y81.0 ニードルを500 mm/minの速度で次のサンプルコンティアイナーに移動します G0 F100 Z0 100 mm/minの速度で印刷を開始したのと同じz位置にサンプルコンティオイナーに針を下ろします G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 20 μL のバイオインクを、現在位置を設定した 50 μL/分の供給速度でマトリックスに押し出します G0 F200 Z60 ニードルをマトリックスから引き出し、200 mm/minの速度でコンティアナをサンプリングします G0 F500 X126.21 Y81.0 ニードルを500 mm/minの速度で次のサンプルコンティアイナーに移動します G0 F100 Z0 針を次のサンプルコンティアイナーに下げ、100 mm/minの速度で印刷を開始したのと同じz位置にします。 G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 20 μL のバイオインクを、現在位置を設定した 50 μL/分の供給速度でマトリックスに押し出します G0 F200 Z80 ニードルをマトリックスから引き出し、200 mm/minの速度でコンティアナをサンプリングします 表1:バクテリア懸濁液の垂直線を印刷するためのGコードプログラミング。 補足ファイル1:シリンジ押出機用のボトムクランプ1mL使い捨てルアーロックシリンジのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル2:シリンジ押出機用の1 mLディスポーザブルルアーロックシリンジ用トップクランプのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル3:シリンジ押出機用の1 mL使い捨てルアーロックシリンジ用シリンジアダプターのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル4:キュベットサンプルホルダーのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル5:ティッシュフラスコサンプルホルダーのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル6:6ウェルプレートおよび35 mmペトリディッシュプリントベッドのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル7:パーティクル追跡用のカスタムスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。