JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Ambiente

Feltinnsamling og laboratorievedlikehold av baldakindannende kjempetare for å lette restaureringen

Published: June 07, 2024
doi:
10.3791/66092
, , , , , , , , , , ,
1Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California, Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California, Santa Cruz, 3Facultad de Ciencias Marinas,Universidad Autónoma de Baja California, 4Facultad de Ciencias,Universidad Autónoma de Baja California, 5Instituto de Investigaciones Oceanológicas,Universidad Autónoma de Baja California, 6The Nature Conservancy

Summary

Denne protokollen beskriver feltinnsamling og regelmessig laboratorievedlikehold av substrater sådd med baldakindannende gigantisk tare for bruk i restaureringsforsøk for å løse suksessen og begrensningene til “grønn grus” -teknikken i feltinnstillinger.

Abstract

Baldakindannende tare er viktige grunnarter, som støtter biologisk mangfold og gir økosystemtjenester verdsatt til mer enn USD 500 milliarder årlig. Den globale nedgangen av gigantiske tareskoger på grunn av klimadrevne økologiske stressorer understreker behovet for innovative restaureringsstrategier. En fremvoksende restaureringsteknikk kjent som “grønn grus” tar sikte på å frø unge tare over store områder uten omfattende undervannsarbeid og representerer et lovende restaureringsverktøy på grunn av kostnadseffektivitet og skalerbarhet. Denne videoartikkelen illustrerer en protokoll og verktøy for dyrking av stortare, Macrocystis pyrifera. Det gir også en ressurs for videre studier for å løse suksessene og begrensningene til denne metoden i feltinnstillinger. Vi skisserer felt- og laboratoriebaserte metoder for å samle reproduktivt vev, sporulere, inokulere, oppdrette, vedlikeholde og overvåke substrater sådd med tidlige livsstadier ved hjelp av “grønn grus” -teknikken. Protokollen forenkler og sentraliserer dagens restaureringspraksis på dette feltet for å støtte forskere, ledere og interessenter i å møte kelpbevaringsmål.

Introduction

Tarelydende tare (brune makroalger i ordenen Laminariales) er globalt viktige basisarter, og dominerer kystnære steinrev i tempererte og arktiske hav1. Disse tarene danner strukturelt komplekse og svært produktive biogene habitater kjent som tareskoger som støtter taksonomisk mangfoldige marine samfunn2. Tareskoger over hele verden leverer mange økosystemtjenester til mennesker, inkludert kommersiell fiskeriproduksjon, karbon- og næringssyklus og rekreasjonsmuligheter, med en samlet estimert verdi på USD 500 milliarder per år3.

Til tross for sin betydelige verdi står tareskogene overfor økende menneskeskapt press i mange regioner3. Klimaendringer utgjør en av de viktigste truslene mot tare på grunn av langsiktig havoppvarming kombinert med den økende frekvensen av temperaturavvik 3,4,5,6,7. Økte havtemperaturer er forbundet med næringsbegrensning8, mens eksponering for varmestress over fysiologiske terskler kan resultere i dødelighet9. I kombinasjon med variable regionale lokale stressorer7 synker tarebestandene globalt med ca. 2 % per år10 med betydelige tap og vedvarende forflytninger til alternative samfunnsstater i visse regioner 6,11,12,13,14. Naturlig gjenoppretting av tarebestander alene kan ikke være tilstrekkelig til å reversere omfanget av nåværende og forventede tap 15,16,17,18, noe som understreker viktigheten av aktiv restaurering.

Nåværende tarestaureringsarbeid kan bruke en kombinasjon av metoder for å gjenopprette disse viktige fundamentartene på kystnære steinete rev 3,19. Metoder som velges for å adressere stedsspesifikke bekymringer, avhenger av geografisk kontekst, de spesifikke hindringene for tareutvinning og den sosialøkologiske konteksten11. Å forstå sammenhengene og den gjensidige avhengigheten mellom sosialøkologiske systemer er nøkkelen, og intervensjoner som engasjerer lokale institusjoner og får støtte fra lokalsamfunn øker sannsynligheten for vellykket restaureringsarbeid20.

I tillegg til klimaendringer driver, beitedyr press eller interspesifikk konkurranse driver, avtar, eller undertrykker utvinningen (f.eks av kråkeboller13, planteetende fisk 21,22, torv alger 9,23, eller invasive alger24). Restaurering kan fokusere på fjerning av disse biotiske stressorene25, selv om disse metodene krever betydelige ressurser og kontinuerlig vedlikehold11. For å katalysere gjenoppretting av kelparter har det vært innsats mot en direkte såingsmetode, for eksempel veiing av nettposer fylt med fruktbare tareblader til bunndyrene som frigjør zoosporer i miljøet26. Denne metoden er imidlertid tidkrevende og krever teknisk undervannsinstallasjon og fjerning. Andre tilfeller fokuserer på transplantasjon av store mengder hele voksne donorplanter, som kan kompromittere nært tilknyttede og sårbare donorpopulasjoner og ofte er begrenset til små skalaer på grunn av avhengighet av kontinuerlig transplantasjon27.

For regioner, hvor taresporebegrensning kan hindre gjenoppretting av tareskog på grunn av habitatfragmentering, ble det introdusert en relativt ny tarestaureringsmetode kalt “grønn grus” -teknikk. Teknikken ble vellykket testet på Flødevigen forskningsstasjon i Sør-Norge28 og representerte et lovende alternativ for restaurering på grunn av kostnadseffektivitet og skalerbarhet. Arbeidsflyten til denne teknikken er som følger: (1) en sporeløsning er laget av fruktbart vev samlet fra reproduktive voksne tare i feltet og deretter sådd på små underlag, for eksempel grus; (2) tidlig stadium kelps er oppdrettet i laboratoriekontrollerte abiotiske forhold på substrater; (3) Substrater med synlige sporofytter er utplassert i feltet på bestemte rev som “grønn grus”, hvor sporofytter fortsetter å vokse. Merk at typiske transplantasjonsforsøk hos voksne individer krever arbeidskrevende og kostnadshemmende undervannsinstallasjon av dykkere, og “grønn grus” -teknikken bruker enkel utplassering fra overflaten28.

Den grønne grusteknikken blir for tiden prøvd ut av medlemmer av en rekke internasjonale arbeidsgrupper,29 på tvers av forskjellige miljøer og flere laminære tarearter. Denne protokollen beskriver de nødvendige fasilitetene, materialene og metodene for vevsoppsamling, sporulering, såing, oppdrettsforhold, regelmessig vedlikehold og overvåking av tidlig stadium kelp før du distribuerer denne restaureringsteknikken i feltet ved hjelp av gigantisk kelp, Macrocystis pyrifera. Denne protokollen er en verdifull ressurs for forskere, ledere og interessenter som ønsker å gi innsikt i suksessene og begrensningene til denne metoden med M. pyrifera i forskjellige feltinnstillinger.

Protocol

Tarevev brukt som beskrevet i denne protokollen ble samlet inn og overvåket av California Department of Fish and Wildlife under tillatelse S-202020004-20205-001. 1. Klargjøring av anlegg og materialer Sørg for at taredyrkingsanlegg kan opprettholde temperaturen (10-15 °C), gi fullspektret lys (0-180 μmol fotoner m-2 s-1) og filterlufting (0,2 μm porestørrelse). Bruk inkubatorsystemer med innebygd uttak eller tilgangsport for ledninger og slanger, lys og luftkilde (figur 1). Hvis et inkubatorsystem ikke er innenfor prosjektets omfang, budsjett eller tiltenkt skala, bruk vannbad temperert av kjølig, naturlig sjøvann eller en kjøler (figur 2). Se materialfortegnelsen for spesifikke detaljer.Plasser et termometer i vekstmediet eller bruk en temperaturpistol for å sikre at temperaturen er mellom 10-18 °C.MERK: Oppdrettstemperaturene er steds- og sesongspesifikke30. Programmer fullspektret lys til en fotoperiode på 12 timers lys: 12 timer mørkt ved å endre tidsinnstillingene på lyskilden eller ved å bruke en mekanisk timer. Mål lysintensiteten med en vanntett fotosyntetisk aktiv stråling (PAR) kvantemåler under overflaten nær grusen og juster ved hjelp av en dimbar lyskilde eller ved lagdeling av cellofan (ved vegetativ gametofyttdyrking, se pkt. 9) eller netting over lyskilden (for detaljer om justering av lysintensitet, se pkt. 6.3). Sørg for riktig lufting ved å bruke luftpumper31 en dag etter sporulering. Bruk filtre (0,2 μm porestørrelse) for å redusere luftbåren bakteriell forurensning.MERK: For dyrking av grønt grus må luftetrykket være tilstrekkelig til å sirkulere vann i alle dyrkningsbeholdere, samtidig som det ikke forstyrrer festingen av tare i tidlig stadium til sådde substrater. Dersom det foreligger bulking av gametofyttbiomasse (se pkt. 9.2), må luftetrykket være tilstrekkelig til å holde gametofytter suspendert i dyrkningsmediet. Steriliser materialer og stasjoner. Forbered disse på forhånd (se Materialfortegnelse).Rengjør overflater med 70% isopropylalkohol. Håndter reproduktivt sorivev og rent oppsamlingsutstyr utenfor barnehagen “grønn grus”, hvis mulig. Bruk følgende steriliseringsmetoder: skyll med et vaskemiddel av laboratoriekvalitet etterfulgt av en grundig skylling med destillert vann, suge i en fortynnet blekemiddelløsning (i henhold til produsentens instruksjoner) etterfulgt av en grundig skylling med destillert vann og autoklav ved bruk av passende innstillinger (glass eller instrumenter). Etter sterilisering kan materialer lagres i en forseglet beholder eller pakkes inn med folie. Skrubb og rengjør beholdere med lokkene som skal brukes til dyrking ved hjelp av et vaskemiddel av laboratoriekvalitet, etterfulgt av en grundig skylling med destillert vann.MERK: Lokkekulturbeholdere vil bidra til å redusere fordampningen av vekstmedier. La lokkene stå litt åpne for å tillate luftutveksling, eller bruk en tilbakeslagsventil for å redusere luftbåren forurensning. Hvis beholdere med lokk ikke er tilgjengelige, må du forsegle kulturbeholdere med en termoplast som parafinfilm og lage 2-3 perforeringer. Hvis større tanker brukes, bruk fordampningsdeksler laget av gjennomsiktig plast. Sørg for at grus har en strukturert eller litt pitted overflate siden gametofytter er mer sannsynlig å bli beholdt på underlag med høy rugøsitet32,33. Skrubb og skyll grus til vannet renner klart for å fjerne støv eller rusk. Bløtlegg grus i en 10 % fortynnet blekemiddelløsning i minst 24 timer og skyll med filtersterilisert sjøvann (se pkt. 2.1). Alternativt, etter skrubbing og skylling, bløtlegg grus i 1 uke i de-ionisert (DI) vann32.MERK: Ideelt sett brukes lokalt høstet substrat for å redusere forurensning av restaureringsstedet. Alternativt anbefales grus i akvariumkvalitet. Unngå kalkholdige substrater som kalkstein, noe som kan føre til vevsbleking og påfølgende dødelighet av transplanterte tare32. 2. Forberedelse av vekstmedier Filtrer og steriliser sjøvann i henhold til følgende metoder, avhengig av ressurstilgjengelighet. Beregn volumet av filtersterilisert sjøvann som trengs for å oppdatere kulturbeholdere hver uke (se avsnitt 7) og planlegg denne filtrerings-/steriliseringsoppgaven deretter. Oppbevar store mengder filtersterilisert sjøvann i mørke beholdere i opptil 6 måneder ved 8-10 °C. Hvis kjøling ikke er tilgjengelig, oppbevares i et mørkt, kjølig område.Filtrer vann ved hjelp av et vakuumfiltreringssystem med en porestørrelse på 0,55-1 μm. Slå av vakuumkilden før alt vannet trekkes gjennom for å unngå å skade filteret, og hell det filtrerte vannet i en dedikert steril beholder. For større volumer, bruk et gjennomstrømningsfiltreringssystem. For eksempel, kjør sjøvann gjennom en serie med tre plisserte filtre (10 μm, 5 μm og 1 μm) arrangert fra største til minste porestørrelse.MERK: Hvis naturlig sjøvann ikke er tilgjengelig, kan kunstig sjøvann tilberedes. Alternativt kan naturlig sjøvann kjøpes fra akvariebutikker, i bulk og blir ofte filtrert, desinfisert og pH-balansert. Medieberikelse er fortsatt nødvendig for disse alternativene. Steriliser filtrert sjøvann ved hjelp av UV- og/eller autoklavermetoder. Koble gjennomstrømningssystemer til et akvarium UV-lys med en strømningshastighet anbefalt av produsenten. Autoklav sjøvann i autoklavsikkert glass med svakt åpne lokk eller dekket med folie og på væskesyklus (121 °C; 1-2 PSI, 15-30 min avhengig av væskevolum34.MERK: Autoklavering filtrert sjøvann anbefales for de tidlige stadiene av kulturen. Anrikning av filtersterilisert sjøvann med næringsstoffer og vitaminer er avgjørende for M. pyrifera vekst. Provasoli Enriched Seawater media (PES) er et mye brukt medium designet for algekulturer35. Kjøp dette mediet fra algekultursentre. Preparater av PES og ytterligere vitaminer for M. pyrifera vekst er beskrevet i34.Berik hver 1 liter filtrert sjøvann med 20 ml PES. Alternativt kan du bruke dyrkingsmedier på industrielt nivå. Oppbevar berikelsesløsninger i henhold til produsentens anbefalinger. Berik filtersterilisert sjøvann når vekstmedier er nødvendig for å unngå nedbrytning av anrikningsløsninger. 3. Innsamling av felt Bestem tidspunktet for sporofyllsamlinger for å etterligne den naturlige reproduktive syklusen til lokale M. pyrifera-populasjoner. Rådfør deg med lokale eksperter (f.eks. Tareforskere, ledere, økologer, borgerforskere, dykkegrupper) for å sikre passende timing for sporofyllinnsamling. Få de nødvendige tillatelsene for innsamling av tarevev som oppfyller lokale lover og forskrifter. Dette kan være en tidkrevende del av dyrkingsprosessen og må innarbeides i prosjektets tidslinjer. Ved selvstendig undervanns pusteapparat (SCUBA) for å velge 3-5 sporofyllblad fra 10-15 fruktbare M. pyrifera individer med synlig sori, fordelt minst 2 m fra hverandre. Velg rene og intakte sporofyller, hvis mulig, med liten eller ingen begroing eller nedbrytning. Oppbevar sporofyllbladene separat i henhold til foreldrepersonen fra dette tidspunktet.MERK: Sporofyller vokser i et tett “skjørt” ved basen, over holdfast av den voksne taren, og kan identifiseres ved deres mangel på gassfylte pneumatocyster1. Eldre sorusvev er ofte litt hevet og mørkere i fargen enn omkringliggende vev1. Transporter sporofyllblader i mørke oppsamlingsposer for å unngå overeksponering for sollys, med minimalt med sjøvann fra stedet for å holde bladene våte, og oppbevar i kjølere ved ca. 12 °C til ankomst til dyrkingsområdet. Sørg for at prøvene ikke er i direkte kontakt med is.MERK: Sporofyller kan sendes til eller fra andre steder.Skyll sporofyller med sjøvann. Pakk kniver, samlet fra en enkelt M. pyrifera individ, i fuktige papirhåndklær dynket i sjøvann og igjen i aluminiumsfolie for å unngå lyspenetrasjon og ytterligere uttørking36. Denne metoden for lagring er kjent som “burrito-metoden”. Plasser disse pakkene i en kjøler med is, med en beskyttende barriere som resirkulert bobleplast eller papp. Forbered kjøleren for forsendelse over natten. Sørg for at noen er tilgjengelig for å motta forsendelsen og legg pakkene i kjøleskap. 4. Sporulering Hvis mulig, behandle sporofyller i et temperaturkontrollert miljø mellom 10-15 ° C og vekk fra andre kulturer. Forbered og steriliser instrumenter og stasjoner på forhånd. Bruk vernehansker ved håndtering av tarevev for å redusere forurensning. Oppbevar eventuelt sporofyller i 12-48 timer i kjøleskap, og oppmuntre sporefrigjøring fra sorusvev37. For å lagre, bruk “burritometoden” beskrevet i pkt. 3.3. Velg modent sorusvev og kutt det i 25 cm2 seksjoner ved hjelp av steril saks. Velg 1-2 rene sorisnitt fra 10-15 individuelle tareforeldre, for å fremme genetisk mangfold.MERK: Hvis lagret, eventuelt finne bevis på delvis sporulering på papirhåndklær, noe som indikerer tilstedeværelsen av fruktbart sorusvev. Sorusvev er ofte litt hevet og mørkere i fargen enn omkringliggende vev. For å rengjøre, skrubb forsiktig begge sider av sorusvevet i en retning bare med en steril gasbind fuktet med filtersterilisert sjøvann. Hvis nødvendig, skrap sorusvevet forsiktig med et sterilt barberblad for å fjerne begroing helt. Senk soriseksjonen i et ferskvannsbad i 30 s til 1 min og skyll med filtersterilisert sjøvann.MERK: Oppdater ferskvannsbadet og steriliser materialene som brukes ved håndtering av forskjellige sori-seksjoner fra forskjellige individer for å redusere krysskontaminering. Senk hver soriseksjon i filtersterilisert sjøvann herdet til 10-15 °C i et sterilt 50 ml sentrifugerør. Plasser rørene ved 4-12 °C i mørket for å sporulere i maksimalt 4 timer. Hvis et kjøleskap ikke er tilgjengelig, oppbevar det på et kjølig sted med lite lys.MERK: Alternativt kan sori-seksjoner sporuleres i en enkelt, steril beholder. Bruk et sammensatt mikroskop og hemocytometer til å observere sporetettheten på 3-4 prøver hvert 30. minutt opptil 4 timer. Bytt pipettespisser mellom prøvene. Hvis tettheten er minst 10 000 sporer ml-1 (se pkt. 5.1.1), gå videre til neste trinn. Hvis et sorisnitt ikke produserer sporer etter 4 timer, kast prøven. Sporer kan bosette seg i løpet av timer etter utgivelsen, men kan observeres svømmende i en sirkulær bevegelse. Fjern hver sori-seksjon fra rørene med steril pinsett. Kombiner de resulterende sporeoppløsningene i en enkelt, sterilisert beholder og kvantifiser den endelige kombinerte tettheten. 5. Inokulering Beregn det endelige volumet av sporeoppløsning som trengs for inokulering. Sørg for at den endelige konsentrasjonen er ca. 500-1000 sporer ml-1 i dyrkningsbeholdere.For å beregne konsentrasjonen av den kombinerte sporeprøven fra tellinger av sentergitteret til hemocytometeret, divider tellingen med 10-4 ml (som representerer volumet av oppløsning sett i hemocytometeret). For å bestemme volumet av sporeoppløsningen som skal legges til hver beholder, bestem mengden vekstmedier som trengs for å senke substrater i kulturbeholdere. For å finne det totale antall sporer i hver beholder, multipliser dette sjøvannsvolumet med ønsket konsentrasjon. For å bestemme det totale volumet av sporeoppløsning som skal tilsettes, del den totale mengden sporer med konsentrasjonen av sporer per ml i sporeoppløsningen. Plasser sterile glassglass i kulturbeholdere for å overvåke tareutviklingen. Inkluder minst 30 lysbilder fordelt tilfeldig på tvers av kulturbeholdere for tilstrekkelig overvåking (se detaljer i avsnitt 7). Inokuler det beregnede volumet av sporeoppløsning i dyrkningsbeholderen ved hjelp av en steril pipettespiss som inneholder substrater nedsenket i vekstmedier. Lukk beholderen og rør forsiktig for å fordele sporer. Forsegl og plasser beholderen i kultursystemet. 6. Oppdrettsforhold Still inn temperaturen mellom 10-15 °C basert på temperaturen på distribusjonsstedet. Etter 1 dag, sørg for lett lufting med en filtrert luftkilde. Sett fullspektret LED-lys for vannplanter til en 12 timers lys: 12 timers mørk syklus, med lysintensiteter mellom 0-180 μmol foton m-2 s-1:Sett lysintensiteten til 5-10 μmol foton m-2 s-1 fra 0-1 dag og øk til 20 – 30 μmol foton m-2 s-1 gjennom slutten av 1 uke. Fra dette punktet øker du bestrålingen med 10-20 μmol foton m-2 s-1 hver 3-4 dag til du når en bestråling på 180 μmol foton m-2 s-1 på slutten av 6 wk. Fortsett til bakkulturer ved 180 μmol foton m-2 s-1 til slutten av 8 wk, eller når sporofytter har nådd omtrent 1-2 cm i lengde. 7. Overvåking Overvåk minst to tilfeldige glassglass daglig / annenhver dag de første to ukene for å vurdere utviklingen.For å overvåke, håndter lysbildet med sterilisert pinsett og legg det i en ren petriskål som inneholder nok sterilisert sjøvann til å senke glassglasset. Ikke returner glassglass til kulturer etter at de er fjernet for å unngå krysskontaminering. Bruk et sammensatt eller invertert mikroskop ved 40-400x forstørrelse for å observere kelps i tidlig stadium. Følg utviklingen med følgende tidslinje (se figur 3for eksempler på utviklingsmessige livshistoriestadier).MERK: Avgjorte sporer observeres ved 0-1 d. Sporer kan spire innen få timer, som demonstrert ved dannelsen av et bakterierør. Spiring observeres vanligvis ved 1-2 d. Tidlige gametofytter observeres vanligvis ved 1-4 d. Gametogenese, prosessen der celler gjennomgår deling og differensiering for å danne mannlige og kvinnelige gameter, observeres vanligvis i løpet av de første to ukene. Kvinnelige celler er 5-7 ganger større enn menn. Mannlige gametofytter vokser tynne, trådformede grener, mens kvinner er mer runde eller ovoide i form. Hunnene produserer vanligvis egg eller egg innen 2-3 uker. Sperm frigjort fra hannene svømmer til hunnene og befrukter eggene, noe som resulterer i dannelsen av diploide zygoter. Å ha riktig inokulasjonstetthet vil sikre vellykket reproduksjon ved nærhet38,39. Befruktede egg utvikler seg til embryonale sporofytter. Sporofytter observeres vanligvis innen 2-4 uker. Zygoten gjennomgår rask celledeling, noe som resulterer i vekst av 1-2 cm blader innen ca. 6-8 uker. Etter to uker, overvåke minst to tilfeldige glassglass 1-2 ganger i uken for sunn vekst og forurensning til sporofytter når 1-2 cm i størrelse.MERK: Sunn vekst er preget av gyldenbrun (i motsetning til grønn eller gjennomsiktig) farge. Det er flere kvantitative beregninger som kan observeres på glassglass med et omvendt mikroskop, inkludert overlevelse, spiringshastighet, vegetativ utvikling, reproduktiv modenhet og fecundity og kjønnsforhold40. Vurder forurensning av bakterier, sopp, ciliater og kiselalger med et mikroskop. Fjern isolert forurensning. Kontroller tidlige tegn på diatomekontaminering med behandling med germaniumdioksid (GeO2) (se pkt. 8.3). 8. Vedlikehold Juster lysforholdene i henhold til Seksjon 6.3. Hver uke, bytt vekstmedier for å fylle opp de nødvendige næringsstoffene og mineralene for M. pyrifera vekst.Avkjøl friske vekstmedier til riktig temperatur. Sørg for at temperaturen ikke overstiger 15 °C under denne prosessen. Sifonmedier ut av dyrkingsbeholderne for å unngå å forstyrre frøede underlag. La mediet renne av til beholderen er nesten tom. Oppdater mediet umiddelbart for å minimere uttørking. Når du fyller på vekstbeholdere, vipp dem litt slik at media renner ned på siden av dyrkingsbeholderen for å forstyrre underlaget minimalt. Omorganiser beholder- eller karposisjonene tilfeldig under ukentlige medieendringer for å ta hensyn til forskjeller i lysinnstråling.Se tilleggsfil 1 for en kalender for å spore aktiviteter og forventninger til Macrocystis-kulturer. Det indikerer tidspunktet for justeringer av lys og lufting, samt ukentlige medieendringer. Eventuelt kontroll diatom forurensning med en behandling av germaniumdioksid (GeO2). Tilsett 0,3-0,5 ml 250 mg / ml GeO2 til hver 1 liter sjøvann tilsatt de frøede substratene for å redusere utbredt diatomforurensning.MERK: GeO2 kan hemme algekjønnscelleproduksjonen. Påfør en behandling av GeO2 i det korte vinduet etter spiring og før topper av egg- og sædproduksjon (1-7 d) og / eller etter eggbefruktning og sporofyttobservasjoner (>21 d), etterfulgt av en medieendring 48 timer etter for å fjerne kjemikaliet. Disse tidslinjene kan variere gitt kulturforhold, så overvåking av livsfaseutvikling med mikroskopi er den beste måten å vurdere tidspunktet for GeO2-applikasjonen . Hvis diatomforurensning vedvarer i kulturbeholdere og gjengroing på tidlig stadium kelps observeres, bør du vurdere å så substratene på nytt. 9. Vegetativ gametofyttdyrking av kjempetare Forplante gametofyttkulturer i vegetative forhold året rundt for å redusere avhengigheten av sesongmessig sporofyllsamling fra det naturlige revet.Oppbevar gametofyttkulturer i henhold til kildepopulasjonen i kolber fylt med vekstmedier ved 4-12 °C i rødt lys med en intensitet på 5-20 μmol foton m-2 s-1 i en 12 lys: 12 mørk syklus. Sørg for konstant lufting og bytt media hver 2-6 måned. For å bulke opp biomasse av gametofytter som har vokst aseksuelt for bruk i “grønn grus” såing, øke luftingen for å suspendere gametofytter, øke frekvensen av medieendringer til ukentlig og fragmentere gametofytter annenhver uke.Suspender gametofyttbiomasse i kulturkolben ved å riste eller røre og skrape sidene av kulturkolben med et sterilt verktøy for å løsne vedlagte gametofytter, om nødvendig. Hell de suspenderte gametofytter i en steril blender eller kaffekvern og pulser gametofyttløsningen i 1-2 s ca. 5-15 ganger, avhengig av biomassekonsentrasjon, til ingen klumpede masser er synlige. For å indusere reproduksjon for “grønn grus” såing, fragment gametofytter, som forklart ovenfor. Deretter inokulerer substratet og øker fullspektret LED-lys fra 5-20 til 45-60 μmol foton m-2 s-1 (+10 μmol foton m-2 s-1 daglig for fotoakklimatisering), øk deretter med 10-20 μmol foton m-2 s-1 hver 3-4 d til du når en bestråling på 180 μmol foton m-2 s-1. 10. Distribusjon Etter 6-8 wk laboratoriedyrking, sørg for at unge sporofytter er 1-2 cm lange og klare for utsetting (figur 4). Oppdater vekstmedier i kulturbeholdere 24 timer før distribusjon. Få de nødvendige tillatelsene for grusutsetting som oppfyller lokale lover og forskrifter. Dette kan være en tidkrevende del av dyrkingsprosessen og må innarbeides i prosjektets tidslinjer. Transporter “grønn grus” i brett dekket med håndklær dynket i sjøvann for å holde taren hydrert. Plasser brett i isolerte kjølere med is, slik at de ikke er i direkte kontakt med is. Forsikre deg om at den “grønne grusen” er tett pakket for å unngå rulling av underlag og sporofyttløsning under transport.MERK: Avhengig av plasstilgjengeligheten kan underlag også transporteres i kulturbeholdere eller kar for å redusere håndtering. Transporter “grønn grus” i opptil 6 timer i en skyggefull kjøler. Distribusjonen bør tidsberegnes for å unngå det mest direkte sollyset. Hvis du distribuerer fra en båt, bruk en skyggelagt struktur for å unngå direkte sol under distribusjonsprosessen. Spre forsiktig “grønn grus” fra overflaten til revet under eller via SCUBA når du prøver på nye steder og i små skalaer.

Representative Results

Restaureringsteknikken for “grønn grus” er fortsatt i pilotfasen, med begrensede overlevelsesdata for andre arter28, og ingen publiserte data ennå for Macrocystis pyrifera. Ved hjelp av feltinnsamling og laboratorievedlikehold som er skissert i denne protokollen, testet vi betydningen av stedsspesifikke oppdrettsforhold for to forskjellige donortarepopulasjoner før hypotetisk ” grønn grus” -distribusjon (figur 5). Reproduktivt tarevev ble samlet inn i California (USA) fra kjøligere K1 (Santa Cruz 36.60167°N, 121.88508°W) og varmere K4 (San Diego, 32.85036°N, -117.27600°W) populasjoner og oppdrettet ved to temperaturer: (1) 12 °C (standard dyrkingstemperatur for tangoppdrett, og gjennomsnittlig vinter-SST for K1), og (2) 20 °C (gjennomsnittlig sommer-SST for K4, og en hetebølge på 4 °C for K1). Alle glassglass som ble brukt til overvåking av kelplivsfaseutvikling ble merket med et standardisert rutenett, og høyoppløselige bilder ble tatt ved hjelp av dette rutenettet som referanse for å muliggjøre observasjon av faste felt over tid ved hjelp av et invertert mikroskop og kamera (N = 5 bilder per prøve, 2.479 mm x 1.859 mm). Etter 24 d post sporulering ble gametofytter regnet fra mikroskopbilder (N = 300 bilder fra 60 prøver). For å teste for forskjeller i antall gametofytter ble generaliserte lineære blandede effektmodeller brukt med Poisson-fordeling ved bruk av funksjonen glmmTMB() i pakke glmmTMB41, og parvise sammenligninger ble utført med emtrends() fra pakkeemmeans42i R. Våre resultater illustrerer at gametofytters respons på termisk variabilitet var forskjellig mellom K1- og K4-populasjoner (t = 2,7, p = 0,007), der temperatur ikke hadde effekt for den varmere K4-populasjonen (estimat = -0,01, standardfeil [SE] = 0,01, konfidensintervall [KI] = [-0,03, 0,01]), men hadde effekt for den kjøligere K1-populasjonen (estimat = -0,06, SE = 0,02, CI = [-0,10, -0,03]) (figur 6A), noe som tyder på en mulig adaptiv divergens i termiske toleransetrekk. Kelp gametofytter er ofte avbildet som et motstandsstadium43, noe som betyr at de produserer en allsidig fenotype som er stresstolerant og relativt ufølsom for miljøvariabilitet. Disse resultatene indikerer imidlertid at termisk variabilitet medfører et betydelig press på dette tidlige stadiet. Etter 32 d postsporulering ble synlige sporofytter med lengder større enn ca. 1 mm talt i sin helhet av hvert 2,5 cm x 7,5 cm glassglass (N = 72 prøver totalt). For å teste for forskjeller i synlige sporofyttantall ble generaliserte lineære blandede effektmodeller brukt med Poisson-fordeling ved bruk av funksjonen glmmTMB() i pakkeglmmTMB og parvise sammenligninger ble utført med emtrends() fra pakkeemmeans i R. Våre resultater illustrerer at sporofytters respons på termisk variabilitet er lik mellom K1- og K4-differensierte populasjoner (z = 0,92, p = 0,36), der temperaturen hadde effekt for den varmere K4-populasjonen (estimat = -0,66, SE = 0,04, CI = [-0,74, – 0,57]), samt den kjøligere K1-populasjonen (estimat = -0,85, SE = 0,13, CI = [-1,10, -0,60]) (figur 6B). Prøver oppdrettet ved 20 °C fikk få synlige sporofytter (gjennomsnitt ± SE = 0,4 ± 0,2) sammenlignet med de som ble oppdrettet ved 12 °C (gjennomsnitt ± SE = 82,4 ± 9,8). Dette resultatet tyder på at sporofyttproduksjonen er mer følsom for temperatur enn gametofyttstadiet, og at stedsspesifikke dyrkingstemperaturer ikke må overstige 15 °C for å oppnå sporofyttutvikling som beskrevet i protokollen. Figur 1: Diagram over ‘ grønn grus’ inkubatorsystem. (A) Rødlyskilde for vegetativt bulking av gametofyttkulturer. (B) Tilgangsport for elektriske ledninger og slanger, som fører til et eksternt uttak. (C) Struktur for å blokkere fullspektret lys ut av rødlysseksjonen. (D) En ” grønn grus” dyrkingsseksjon. (E) fullspektret lyskilder. (F) Rørledninger koblet til en ekstern filtrert luftkilde. (G) Kontrollventiler for å redusere luftbåren forurensning. (H) Individuelle dyrkningsbeholdere som minimerer forurensning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Diagram over ” grønt grus” vannbadsystem. (A) Kjøler med nedsenket pumpe (i I). (B) 20 gallon badekar for vannbad. (C) Tøm for å resirkulere vannbad. (D) Ventil for resirkulering av vannbad. (E) Lyskilde. F) 2,5 l «grønn grusbeholder » med gjennomsiktig lokk og lufteåpning. (G) Luftekilde. (H) Rør som resirkulerer vann ved bruk av nedsenkede pumper. (I) Vannbadmottaker fra/til kjøler fra/til kar med nedsenkbare pumper. (J) Akryldeksel for å minimere fordampning av vannbad. (K) Mesh skygge for å justere lysintensiteten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Utvikling av Macrocystis pyrifera . Utviklingsmessige livshistoriestadier av Macrocystis pyrifera fra laboratorievekstforsøk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: ‘Grønn grus’ sådd med Macrocystis pyrifera. ‘ Grønn grus med Macrocystis pyrifera dyrkes i laboratoriet til sporofytter når 1-2 cm. ‘Grønn grus’ blir deretter satt ut og fortsetter å vokse i feltet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Eksperimentelle tidsserier. Eksempelbilder fra en tidsserie som følger eksperimentell vekst og utvikling av Macrocystis pyrifera gametofytter og sporofytter med opprinnelse fra to populasjoner samlet inn i California (USA) og dyrket ved to forskjellige temperaturer. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Representative resultater. Macrocystis pyrifera livsstadier observert for K1 Santa Cruz San Diego K4 Santa Cruz populasjoner av opprinnelse dyrket ved konstante termiske forhold på 12 og 20 °C. Feilfelt, gjennomsnitt ± 1 SE. Stjerne (*) angir statistisk signifikante forskjeller (p < 0,05). (A) Gatomatytter ved dag 24 (N = 300 bilder totalt fra 60 prøver). (B) Synlige sporofytter ved dag 32 (N = 72 prøver, innenfor et standardisert område på 2,5 x 7,5 cm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Menneskeskapte klimaendringer er en økende trussel mot helsen til verdenshavene 44,45,46,47,48, noe som resulterer i store forstyrrelser og tap av biologisk mangfold 49,50,51,52. For å akselerere restaureringen av forringede økosystemer har FN erklært 2021 til 2030 som «FNs tiår for restaurering av økosystemer», sammenfallende med «FNs tiår for havforskning for bærekraftig utvikling», som har som mål å reversere forverringen av havets helse53. I tråd med denne globale oppfordringen til handling har Kelp Forest Alliance lansert Kelp Forest Challenge for å gjenopprette 1 million hektar og beskytte 3 millioner hektar tareskog innen år 204054. Marin restaurering er undervurdert55, og tareøkosystemer får betydelig mindre oppmerksomhet enn habitater som korallrev, mangroveskog og sjøgressenger56. Restaurering av forringede økosystemer har vist seg å være effektiv i gjenoppbygging av marine økosystemer, men kan koste i gjennomsnitt mellom $ 80.000 – $ 1.600.000 per hektar, med median totale kostnader sannsynligvis to til fire ganger høyere57. Nåværende og projiserte tap krever å utvikle skalerbare, gjennomførbare og kostnadseffektive kelprestaureringsmetoder som presserende bevaringsintervensjoner.

Nåværende tarestaureringsarbeid bruker en kombinasjon av metoder for å adressere stedsspesifikke drivere for kelptap, inkludert transplantasjon av voksne kelps, direkte såing av zoosporer og / eller gametofytter, beitekontroll og installasjon av kunstige rev11. Disse metodene krever imidlertid betydelige ressurser og har begrenset skalerbarhet. Typisk transplantasjon av voksne tare krever møysommelig utplassering av kunstige materialer eller strukturer på bunndyrene, av dykkere. Bottom-up-intervensjoner for å gjenopprette kystnære steinete rev, som å kontrollere konkurrenter og beitedyr, er også begrenset av lønnskostnader da de er avhengige av manuell fjerning under vann eller utelukkelse av disse biotiske stressorene11. Den grønne grusteknikken overvinner disse begrensningene med enkel distribusjon fra overflaten, og krever ingen undervannsinstallasjon eller teknisk kunnskap og skalerbarhet til relativt lave kostnader28. Denne innovative tilnærmingen gir et lovende restaureringsverktøy, og oppfordrer til omfattende forsøk på forskjellige steder og miljøer for å låse opp det fulle potensialet32.

Mens vellykket restaureringsarbeid med “grønn grus” er dokumentert i skjermede fjorder i Norge ved hjelp av sukkertare, Saccharina latissima26, er denne teknikken fortsatt i pilotfasen for Macrocystis pyrifera i det østlige Stillehavet. Ytterligere forsøk er nødvendig for å adressere forventet overlevelse av M. pyrifera outplants innenfor sitt område. I bølgeeksponerte forhold som er typiske for M. pyrifera vekst, kan mindre grus være mer utsatt for bevegelse og slitasje, noe som fører til skadede utplanter. Videre kan positiv oppdrift fra gassfylte pneumatocyster av M. pyrifera føre til at “grønne grus” -utplanter effektivt blir ført bort fra restaureringsstedet, og dermed er grusstørrelse og vekt viktige faktorer å utforske for denne arten. I en fersk pilotstudie (mai 2022; Ensenada, Baja California, Mexico), er foreløpig suksess i felt med M. pyrifera observert, indikert ved hapterafeste til omkringliggende substrat og vekst av ungdyr som når 1,2 m i lengde etter to måneder i felt (figur 4). Dette viser en klar mulighet som ennå ikke er utforsket ved bruk av “grønn grus” for M. pyrifera i det østlige Stillehavet. Denne videoen viser “grønn grus” – teknikken med M. pyrifera og er en verdifull ressurs som forenkler og sentraliserer eksisterende praksis i dyrkingsfasen av restaurering for å støtte studier som adresserer suksesser og begrensninger i forskjellige feltinnstillinger.

Med “grønn grus” -teknikken kan mange mindre, individuelle grusenheter sås i en skala som kan øke sannsynligheten for suksess sammenlignet med mer vanlige transplantasjonsmetoder med voksne planter. Det viktigste skalerbare aspektet ved denne teknikken er imidlertid den enkle utplasseringen fra overflaten, noe som kan lette restaureringen av store områder med båt. For feltinnstillinger der utsetting av liten grus ikke er egnet, kan denne protokollen tilpasses for å transplantere M. pyrifera på et bredt spekter av underlag, inkludert større grus eller til og med små steinblokker, streng som kan knyttes til naturlige eller utsatte undervannsankre, eller fliser som kan boltes eller limes ved hjelp av marin epoksy til havbunnen under mer utsatte forhold. Disse distribusjonstilpasningene vil ikke endre fasilitetene som trengs for dyrking av M. pyrifera , men vil senere øke kostnadene ved distribusjon.

Menneskeskapte forstyrrelser og klimaendringer overvinner for tiden evnen til naturlige befolkninger til å tilpasse seg. Dette utgjør betydelige utfordringer for tradisjonell bevaringsinnsats som gjenoppretter økosystemene til sine historiske tilstander 58,59,60,61,62,63. Dermed er bevaringsrammene utvidet til å omfatte forventningsforvaltning med tanke på motstandskraft og tilpasningsevne64. Forventningsforvaltning for å takle klimaendringer blir implementert for treslag i skogøkosystemer65 og har blitt foreslått for videre restaureringsarbeid for å forbedre det evolusjonære potensialet til utplanter 66,67. Selv om disse strategiene er iboende lettere å manipulere i terrestriske miljøer, begynner flere studier å utforske deres anvendelse i marine miljøer 62,68,69,70. For eksempel er korallrev truet av mange menneskeskapte stressorer som har resultert i enestående nedgang71,72. Som svar på tapene av disse viktige fundamentartene, blir aktiv restaurering og assistert tilpasningsteknikker i økende grad anbefalt for å bevare gjenværende korallrev og deres tilhørende funksjoner 62,73,74. En teknikk innebærer å translokere individer innenfor deres nåværende artsfordelingsområde for å øke toleransen for varmestress75. Når det gjelder restaurering av baldakindannende tare, har “grønn grus” et tilpassbart rammeverk for å utforske assisterte tilpasningsteknikker som translokasjon av elastiske genotyper til sårbare områder, ikke-genetisk manipulering som hybridisering eller akklimatisering av individer til miljøstress62 med resultater rettet mot å oppnå mer resistente stammer for restaureringsprogrammer76,77.

Å utnytte lokal støtte for å forbedre restaureringsarbeidet er avgjørende for å opprettholde suksess for bevaring av kelpøkosystemet. Å engasjere lokale interessenter kan øke lokal innkjøp for restaureringsbehov 6,50 og fremme kystforvaltning som senere kan resultere i økt finansiering og lang levetid for beskyttelse av tareøkosystemet. Som med alle andre metoder for restaurering av tare, vil strukturerte beslutningsrammer som integrerer ulike økologiske, sosioøkonomiske og bevaringsmål bidra til å oppnå optimale resultater for tareøkosystemer og samfunnene de støtter11.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av California Sea Grant Kelp Recovery Research Program R / HCE-17 til JBL og MESB, en National Science Foundation Research Traineeship-pris DGE-1735040 til PDD, The Nature Conservancy, Schmidt Marine Technology Partners, Sustainable Ocean Alliance, Tinker Foundation til AP-L, og The Climate Science Alliance Baja Working Group til RBL og JL. Vi takker Steven Allison, Cascade Sorte, Samantha Cunningham, Sam Weber og Caitlin Yee ved University of California, Irvine; Carr, Peter Raimondi, Sarah Eminhizer, Anne Kapuscinski ved University of California, Santa Cruz; Walter Heady og Norah Eddy på The Nature Conservancy; Filipe Alberto og Gabriel Montecinos ved University of Wisconsin, Milwaukee; Jose Antonio Zertuche-González, Alejandra Ferreira-Arrieta og Liliana Ferreira-Arrieta ved Universidad Autónoma de Baja California; Luis Malpica-Cruz, Alicia Abadía-Cardoso og Daniel Díaz-Guzmán fra MexCal; MexCalitos-dykkerne Alejandra Reyes, Monica Peralta, Teresa Tavera, Julia Navarrete, Ainoa Vilalta, Jeremie Bauer og Alfonso Ferreira; og Nancy Caruso for tekniske råd. Vi takker Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California for å tilby fasiliteter som brukes til å utvikle vannbadsystemet. Vi takker Ira Spitzer for undervanns- og dronevideoinnhold.

Materials

0.22 µm filters Milipore SCGPS05RE Natural seawater sterilization
1 L glass bottles Amazon B07J6JP4D1 Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air) Amazon B01M1VWUWL Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow Home Depot 203812125 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
10 µm filters Amazon B00D04BG56 Natural seawater sterilization
20 µm filters Amazon B082WS9NPH Natural seawater sterilization
3x5mm tubing Amazon B0852HXPN6 Option 1 Small scale – Incubator
4×4'' Sterile Gauze Amazon B07NDK8XM3 Sporulation
4x6mm tubing Amazon B08BCRV1FY Option 1 Small scale – Incubator
5 µm filters Amazon B082WS9NPH Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing Amazon B01M04HGPJ Sporulation
8x10mm tubing Amazon B01MSM3LLZ Option 1 Small scale – Incubator
Air filters Thermo Fisher MTGR85010 Option 1 Small scale – Incubator
Alcohol lamp Amazon B07XWD9WWC Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99% Sigma 215406-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel Amazon B07XRCKFBJ Option 1 Small scale – Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99% Sigma B4639-100MG Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g Thermo Fisher 5090113707 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA Thermo Fisher P001225G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves Amazon B08HRZR4MM Option 1 Small scale – Incubator
Clear tubing 3/8'' – 10 ft Amazon B07MTYMW13 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING – California – Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA Thermo Fisher 5090114752 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera OMAX M83EZ-C50S Monitoring
Culture flask Thermo Fisher 07-250-080 Option 1 Small scale – Incubator
Culture light Amazon B07RRRPJ63 Option 1 Small scale – Incubator
Culture stoppers Amazon B07DX6J7QD Option 1 Small scale – Incubator
Drainage connector Amazon B00GUZ6CV0 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2 Thermo Fisher 50213299 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL Thermo Fisher S81273 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL Thermo Fisher S81275 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets – Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye Thermo Fisher S81271 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder Amazon B07LCKBKCT Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA Thermo Fisher S63460 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera Leica FLEXACAM C1 Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN Thermo Fisher AAJ6083314 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink Amazon B094TLH19L Option 2 – Medium scale – Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR Thermo Fisher AC190000100 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA Thermo Fisher S88442 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides Amazon B00L1S93PS Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture Sigma G6501-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid Container store #10014828 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Growth light Amazon B086R14MFW Option 1 Small scale – Incubator
Hemocytometer Amazon B07TJQDKLJ Sporulation
HEPES 99.5% (titration) Sigma H3375-500G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Hinged plastic jars SKS Bottle & Packaging 40280125.01S Option 1 Small scale – Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size – 100G Storage Conditions – +15 C TO +30 C Catalog Number – 26310.01 CAS 87-89-8 Thermo Fisher 50247745 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean – 50 G Amazon B000255NKA Option 1 Small scale – Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1 Leica DMi1 Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97% Sigma 236489-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger Licor LI-250A Monitoring
Light/temperature HOBO data logger Amazon B075X2SWKN Monitoring
Lights 150W Amazon B0799DQM9V Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications Sigma M8179-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds Home Depot 206823930 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11, Thermo Fisher AAA1268330 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA Thermo Fisher ICN10256925 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement Amazon B001D9WRWG Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve Amazon B0006JLVE4 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve Amazon B07G5FY7X1 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Precision scale 1mg Amazon B08DTH95FN Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air Amazon B0BG2BT9RX Option 1 Small scale – Incubator
PVC tubing 1×24'' Home Depot 202300505 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Quantum Light meter Apogee Instruments MQ-510 Monitoring
Refrigerated Incubator Thermo Fisher 15-103-1566 Option 1 Small scale – Incubator
Rubber Grommets Amazon B07YZD22ZP Option 1 Small scale – Incubator
Salinity refractometer ATC B018LRO1SU Monitoring
Shade mesh 6×50 ft Home depot 316308418 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA Thermo Fisher BP360500 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening Amazon B08R3515SF Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Spray isporopyl alcohol Amazon ‎ B08LW5P844 Sporulation
Stainless steel sissors Amazon B07BT4YLHT Sporulation
Stainless steel tray Amazon B08CV33YXG Sporulation
Stainless steel twizzers Amazon B01JTZTAJS Sporulation
Stir Bars Amazon B07C4TNKXB Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH Amazon B07RZKRM13 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor Waltz US-SQS/L Monitoring
Temperature gun Infrared Thermometer 749 B07VTPJXH9 Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture Sigma T1270-25G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA Thermo Fisher AC157850250 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24×48 inch Home Depot 202038048 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft Amazon B07ZC1PSF3 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization Amazon B018OI7PYS Natural seawater sterilization
Vacum pump Amazon B087XBTPVW Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98% Sigma V6629-100MG Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA Thermo Fisher S89446 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA Thermo Fisher S89445 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM Amazon B07BHHP71C Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing Amazon B08XTJKFCH Option 1 Small scale – Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture Sigma Z0251-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Schiel, D. R., Foster, M. S. . The Biology and Ecology of Giant Kelp Forests. , (2015).
  2. Smale, D. A., Burrows, M. T., Moore, P., O’Connor, N., Hawkins, S. J. Threats and knowledge gaps for ecosystem services provided by kelp forests: a northeast Atlantic perspective. Ecol Evol. 3 (11), 4016-4038 (2013).
  3. Eger, A. M., et al. The value of ecosystem services in global marine kelp forests. Nat Comm. 14 (1), 1894 (2023).
  4. Bennett, S., Wernberg, T., Arackal Joy, B., de Bettignies, T., Campbell, A. H. Central and rear-edge populations can be equally vulnerable to warming. Nat Comm. 6 (1), 10280 (2015).
  5. Jueterbock, A., et al. Climate change impact on seaweed meadow distribution in the North Atlantic rocky intertidal. Ecol Evol. 3 (5), 1356-1373 (2013).
  6. Rogers-Bennett, L., Catton, C. A. Marine heat wave and multiple stressors tip bull kelp forest to sea urchin barrens. Sci Rep. 9 (1), 15050 (2019).
  7. Krumhansl, K. A., et al. Global patterns of kelp forest change over the past half-century. PNAS. 113 (48), 13785-13790 (2016).
  8. Zimmerman, R. C., Kremer, J. N. Episodic nutrient supply to a kelp forest ecosystem in Southern California. J Mar Res. 42 (3), 591-604 (1984).
  9. Rothäusler, E., et al. Physiological performance of floating giant kelp Macrocystis pyrifera (phaeophyceae): Latitudinal variability in the effects of temperature and grazing. J Phycol. 47 (2), 269-281 (2011).
  10. Wernberg, T., Krumhansl, K., Filbee-Dexter, K., Pedersen, M. F. Chapter 3 – Status and trends for the world’s kelp forests. World Seas: An Environmental Evaluation (Second Edition). , 57-78 (2019).
  11. Eger, A. M., Layton, C., McHugh, T. A., Gleason, M., Eddy, N. Kelp restoration guidebook: Lessons learned from kelp restoration projects around the world. TNCKelp Forest Alliance. , (2022).
  12. Filbee-Dexter, K., et al. Marine heatwaves and the collapse of marginal North Atlantic kelp forests. SciRep. 10 (1), 13388 (2020).
  13. Filbee-Dexter, K., Scheibling, R. E. Sea urchin barrens as alternative stable states of collapsed kelp ecosystems. Mar Ecol Prog Ser. 495, 1-25 (2014).
  14. Filbee-Dexter, K., Wernberg, T. Rise of turfs: A new battlefront for globally declining kelp forests. BioSci. 68 (2), 64-76 (2018).
  15. Assis, J., Araújo, M. B., Serrão, E. A. Projected climate changes threaten ancient refugia of kelp forests in the North Atlantic. Glob Change Biol. 24 (1), e55-e66 (2018).
  16. Davis, T., Champion, C., Coleman, M. Ecological interactions mediate projected loss of kelp biomass under climate change. Divers Distrib. 28 (2), 306-317 (2021).
  17. Goldsmit, J., et al. Kelp in the eastern Canadian arctic: Current and future predictions of habitat suitability and cover. Front Mar Sci. 18, 742209 (2021).
  18. Ling, S. D., Cornwall, C. E., Tilbrook, B., Hurd, C. L. Remnant kelp bed refugia and future phase-shifts under ocean acidification. PLoS One. 15 (10), e0239136 (2020).
  19. Eger, A. M., et al. Global kelp forest restoration: past lessons, present status, and future directions. Biol Rev. 97 (4), 1449-1475 (2022).
  20. Waylen, K. A., Fischer, A., McGowan, P. J., Thirgood, S. J., Milner-Gulland, E. J. Effect of local cultural context on the success of community-based conservation interventions. Biol Consv. 24 (4), 1119-1129 (2010).
  21. Vergés, A., et al. The tropicalization of temperate marine ecosystems: climate-mediated changes in herbivory and community phase shifts. Proc Royal Soc. B. 281 (1789), 20140846 (2014).
  22. Zarco-Perello, S., Wernberg, T., Langlois, T. J., Vanderklift, M. A. Tropicalization strengthens consumer pressure on habitat-forming seaweeds. Sci Rep. 7 (1), 820 (2017).
  23. Worm, B., Lotze, H. K. Chapter 21 – Marine biodiversity and climate change. Climate Change (Third Edition). , 445-464 (2021).
  24. Félix-Loaiza, A. C., Rodríguez-Bravo, L. M., Beas-Luna, R., Lorda, J., de La Cruz-González, E., Malpica-Cruz, L. Marine heatwaves facilitate invasive algae takeover as foundational kelp. Botanica Marina. 65 (5), 315-319 (2022).
  25. Miller, K. I., Blain, C. O., Shears, N. T. Sea urchin removal as a tool for macroalgal restoration: A review on removing "the spiny enemies&#34. Fron Mar Sci. 9, 831001 (2022).
  26. Westermeier, R., et al. Repopulation techniques for Macrocystis integrifolia (Phaeophyceae: Laminariales) in Atacama, Chile. J Appl Phycol. 26, 511-518 (2014).
  27. Layton, C., et al. Kelp forest restoration in Australia. Fron Mar Sci. 7, 74 (2020).
  28. Fredriksen, S., et al. gravel: a novel restoration tool to combat kelp forest decline. Sci Rep. 10 (1), 3983 (2020).
  29. . Projects of the Green Gravel Action Group Available from: https://www.greengravel.org/ (2024)
  30. Fain, S. R., Murray, S. N. Effects of light and temperature on net photosynthesis and dark respiration of gametophytes and embryonic sporophytes of macrocystis pyrifera. J Phycol. 18 (1), 92-98 (1982).
  31. Westermeier, R., Patiño, D., Piel, M. I., Maier, I., Mueller, D. G. A new approach to kelp mariculture in Chile: production of free-floating sporophyte seedlings from gametophyte cultures of Lessonia trabeculata and Macrocystis pyrifera. Aquac Res. 37 (2), 164-171 (2006).
  32. Alsuwaiyan, N. A., et al. Green gravel as a vector of dispersal for kelp restoration. Fron Mar Sci. 9, 910417 (2022).
  33. Falace, A., Kaleb, S., De La Fuente, G., Asnaghi, V., Chiantore, M. Ex situ cultivation protocol for Cystoseira amentacea var. stricta (Fucales, Phaeophyceae) from a restoration perspective. PloS One. 13 (2), e0193011 (2018).
  34. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England seaweed culture handbook. , (2014).
  35. Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Arch Mikrobiol. 25, 392-428 (1957).
  36. Navarro, D., Navarro, D. E. . California Kelp Forest Restoration: Science Activity Guide for Teachers. , (2006).
  37. Alsuwaiyan, N. A., et al. A review of protocols for the experimental release of kelp (Laminariales) zoospores. Ecol Evol. 9 (14), 8387-8398 (2019).
  38. Lüning, K., Müller, D. G. Chemical interaction in sexual reproduction of several Laminariales (Phaeophyceae): release and attraction of spermatozoids. Z. Pflanzenphysiol. 89 (4), 333-341 (1978).
  39. Müller, D. G., Maier, I., Gassmann, G. Survey on sexual pheromone specificity in Laminariales (Phaeophyceae). Phycologia. 24 (4), 475-477 (1985).
  40. Vieira, V. M., Oppliger, L. V., Engelen, A. H., Correa, J. A. A new method to quantify and compare the multiple components of fitness-a study case with kelp niche partition by divergent microstage adaptations to temperature. Plos One. 10 (3), e0119670 (2015).
  41. Brooks, M. E., et al. glmmTMB balances speed and flexibility among packages for zero-inflated generalized linear mixed modeling. The R Journal. 9 (2), 378-400 (2017).
  42. Russell, L. emmeans: estimated marginal means, aka least-squares means. R package version. 1 (2), (2018).
  43. Ladah, L. B., Zertuche-González, J. A. Survival of microscopic stages of a perennial kelp (Macrocystis pyrifera) from the center and the southern extreme of its range in the Northern Hemisphere after exposure to simulated El Niño stress. Mar Biol. 152, 677-686 (2007).
  44. Halpern, B. S., et al. A global map of human impact on marine ecosystems. Science. 319 (5865), 948-952 (2008).
  45. Halpern, B. S., et al. Spatial and temporal changes in cumulative human impacts on the world’s ocean. Nat Comm. 6 (1), 1-7 (2015).
  46. Halpern, B. S., et al. Recent pace of change in human impact on the world’s ocean. Sci Rep. 9 (1), 11609 (2019).
  47. Micheli, F., et al. Cumulative human impacts on Mediterranean and Black Sea marine ecosystems: assessing current pressures and opportunities. PloS One. 8 (12), e79889 (2013).
  48. Portner, H. -. O., et al. . IPCC, 2022: Summary for policymakers. , (2022).
  49. Butchart, S. H. M., et al. Global biodiversity: Indicators of recent declines. Science. 328 (5982), 1164-1168 (2010).
  50. Rocha, J., Yletyinen, J., Biggs, R., Blenckner, T., Peterson, G. Marine regime shifts: Drivers and impacts on ecosystems services. Phil Trans Roy Soc. B. 370 (1659), 20130273 (2015).
  51. Worm, B., et al. Impacts of biodiversity loss on ocean ecosystem services. Science. 314 (5800), 787-790 (2006).
  52. Worm, B., Lotze, H. K. Marine biodiversity and climate change. Climate Change (Third Edition). Chapter 21, 445-464 (2021).
  53. Waltham, N. J., et al. UN decade on ecosystem restoration 2021-2030-What chance for success in restoring coastal ecosystems. Fron Mar Sci. 7, (2020).
  54. . Kelp Forest Challenge Available from: https://kelpforestalliance.com/ (2024)
  55. Gordon, T. A. C., Radford, A. N., Simpson, S. D., Meekan, M. G. Marine restoration projects are undervalued. Science. 367 (6478), 635-636 (2020).
  56. Morris, R. L., et al. Key principles for managing recovery of kelp forests through restoration. BioScience. 70 (8), 688-698 (2020).
  57. Bayraktarov, E., et al. The cost and feasibility of marine coastal restoration. Ecol Appl. 26 (4), 1055-1074 (2016).
  58. Breed, M. F., et al. Priority actions to improve provenance decision-making. BioScience. 68 (7), 510-516 (2018).
  59. Breed, M. F., et al. The potential of genomics for restoring ecosystems and biodiversity. Nat Rev Genet. 20 (10), 615-628 (2019).
  60. Gurgel, C. F. D., Camacho, O., Minne, A. J. P., Wernberg, T., Coleman, M. A. Marine heatwave drives cryptic loss of genetic diversity in underwater forests. Curr Biol. 30 (7), 1199-1206.e2 (2020).
  61. Hobbs, R. J., Higgs, E., Harris, J. A. Novel ecosystems: implications for conservation and restoration. Trends Ecol Evol. 24 (11), 599-605 (2009).
  62. Oppen, M. J. H., van Oliver, J. K., Putnam, H. M., Gates, R. D. Building coral reef resilience through assisted evolution. PNAS. 112 (8), 2307-2313 (2015).
  63. Perring, M. P., et al. Advances in restoration ecology: Rising to the challenges of the coming decades. Ecosphere. 6 (8), art131 (2015).
  64. Coleman, M. A., et al. Restore or redefine: Future Trajectories for Restoration. Fron MarSci. 7, 237 (2020).
  65. O’Neill, G. A. . Assisted migration to address climate change in British Columbia: recommendations for interim seed transfer standards. , (2008).
  66. Broadhurst, L. M., et al. Seed supply for broadscale restoration: maximizing evolutionary potential. Evol App. 1 (4), 587-597 (2008).
  67. Vitt, P., Havens, K., Kramer, A. T., Sollenberger, D., Yates, E. Assisted migration of plants: Changes in latitudes, changes in attitudes. Biol Cons. 143 (1), 18-27 (2010).
  68. Buerger, P., et al. Heat-evolved microalgal symbionts increase coral bleaching tolerance. Sci Adv. 6 (20), eaba2498 (2020).
  69. Chakravarti, L. J., van Oppen, M. J. H. Experimental evolution in coral photosymbionts as a tool to increase thermal tolerance. Fron Mar Sci. 5, (2018).
  70. van Oppen, M. J. H., et al. Shifting paradigms in restoration of the world’s coral reefs. Global Change Biology. 23 (9), 3437-3448 (2017).
  71. Harborne, A. R., Rogers, A., Bozec, Y. -. M., Mumby, P. J. Multiple Stressors and the Functioning of Coral Reefs. Ann Rev Mar Sci. 9 (1), 445-468 (2017).
  72. Hughes, T. P., et al. Climate change, human impacts, and the resilience of coral reefs. Science. 301 (5635), 929-933 (2003).
  73. Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nat Ecol & Evol. 1 (10), 1420-1422 (2017).
  74. Darling, E. S., Côté, I. M. Seeking resilience in marine ecosystems. Science. 359 (6379), 986-987 (2018).
  75. van Oppen, M. J. H., Puill-Stephan, E., Lundgren, P., De’ath, G., Bay, L. K. First-generation fitness consequences of inter-populational hybridization in a Great Barrier Reef coral and its implications for assisted migration management. Coral Reefs. 33 (3), 607-611 (2014).
  76. Coleman, M. A., Goold, H. D. Harnessing synthetic biology for kelp forest conservation1. J Phycol. 55 (4), 745-751 (2019).
  77. Liboureau, P., Pearson, G. A., Barreto, L., Serrao, E. A., Kreiner, A., Martins, N. Effects of thermal history on reproductive success and cross-generational effects in the kelp Laminaria pallida (Phaeophyceae). Mar Ecol Prog Ser. 715, 41-56 (2023).

Tags

KelpMacrocystis PyriferaKelp CulturingGreen Gravel TechniqueKelp RestorationTemperature ControlLight RequirementsAerationSterilizationGravel SubstrateSeawater Filtration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Dawkins, P. D., Paz-Lacavex, A., Fiorenza, E. A., Rush, M. A., Beas-Luna, R., Lorda, J., Malpica-Cruz, L., Sandoval-Gil, J. M., McHugh, T. A., Han, M. K., Bracken, M. E. S., Lamb, J. B. Field Collection and Laboratory Maintenance of Canopy-Forming Giant Kelp to Facilitate Restoration. J. Vis. Exp. (208), e66092, doi:10.3791/66092 (2024).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image