La Drosophila è un modello consolidato per lo studio di molecole chiave che regolano la miogenesi. Tuttavia, i metodi attuali sono insufficienti per determinare la dinamica trascrizionale dell’mRNA e la distribuzione spaziale all’interno dei sincizi. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo ottimizzato un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza dell’RNA che consente il rilevamento e la quantificazione degli mRNA su scala di singola molecola.
I muscoli scheletrici sono grandi sincizi costituiti da molte miofibre raggruppate che producono forze e consentono il movimento del corpo. La Drosophila è un modello classico per studiare la biologia muscolare. La combinazione della genetica della Drosophila e di approcci omici avanzati ha portato all’identificazione di molecole chiave conservate che regolano la morfogenesi e la rigenerazione muscolare. Tuttavia, la dinamica trascrizionale di queste molecole e la distribuzione spaziale del loro RNA messaggero all’interno dei sincizi non possono essere valutate con metodi convenzionali. Qui abbiamo ottimizzato un metodo esistente di ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) per consentire il rilevamento e la quantificazione di singole molecole di mRNA all’interno dei muscoli del volo adulto e delle loro cellule staminali muscolari. Come prova di concetto, abbiamo analizzato l’espressione e la distribuzione dell’mRNA di due fattori di trascrizione evolutivamente conservati, Mef2 e Zfh1/Zeb. Mostriamo che questo metodo è in grado di rilevare e quantificare in modo efficiente singole molecole di mRNA per entrambi i trascritti nelle cellule precursori muscolari, nei muscoli adulti e nelle cellule staminali muscolari.
I muscoli scheletrici dell’adulto sono costituiti da miofibre multinucleate differenziate le cui proprietà contrattili generano movimenti. La crescita, il mantenimento e la rigenerazione muscolare si basano su progenitori muscolari e cellule staminali muscolari (MuSC) che vengono specificati durante lo sviluppo embrionale1. Il programma miogenico è finemente controllato da una serie di fattori di trascrizione miogenici (TF) (ad esempio, Pax3/7, MYOD, Mef2 e ZEB)2,3,4. Decifrare i meccanismi molecolari che regolano la biologia muscolare è importante per chiarire le questioni fondamentali relative alla miologia e per un possibile uso terapeutico nel trattamento delle malattie muscolo-degenerative.
La Drosophila ha una lunga storia come modello genetico per studiare la miogenesi5. Recentemente è emerso come un nuovo modello per studiare la rigenerazione muscolare 6,7,8. La struttura muscolare e i programmi miogenici di base sono altamente conservati tra mosche e mammiferi. Ad esempio, i TF Mef2 e Zfh1/ZEB hanno una funzione conservata nella regolazione dello sviluppo e della rigenerazione muscolare 3,9,10,11. I muscoli adulti della Drosophila, come i muscoli del volo indiretto (IFM), sono formati da una popolazione specifica di MuSC, noti come progenitori muscolari adulti (AMP)12. Questi AMP sono specificati durante l’embriogenesi e si associano a strutture epiteliali come i dischi delle ali e delle gambe. Durante gli stadi embrionali e larvali, gli AMP rimangono indifferenziati fino alla metamorfosi, quando si impegnano nella differenziazione e nella fusione per formare gli IFM13,14. Il TF Spalt major (spalt, salm) è espresso durante lo sviluppo muscolare del volo ed è necessario per determinarne l’identità strutturale15. Mef2 è un altro importante TF miogenico che è essenziale per la formazione muscolare adulta16,17. È espresso negli AMP e mantenuto negli IFM adulti10,18. Mentre la maggior parte degli AMP si differenzia in muscoli funzionali, un sottogruppo sfugge alla differenziazione e forma i MuSCadulti 11. Analogamente ai vertebrati, il TF Zfh1/ZEB è necessario per prevenire la differenziazione prematura dei MuSC adulti e per mantenere la loro staminalità 9,10.
È stato dimostrato che le dinamiche di espressione genica regolano vari processi biologici muscolari19,20. L’avvento di tecniche di sequenziamento dell’RNA a singola cellula e a singolo nucleo ad alto rendimento ha permesso un’esplorazione completa di queste dinamiche trascrizionali21,22. Una notevole limitazione di questi approcci è la loro incapacità di fornire la distribuzione spaziale delle molecole di mRNA nelle fibre muscolari multinucleate. Queste caratteristiche possono essere studiate mediante ibridazione in situ a fluorescenza a singola molecola (smFISH) che rivela due tipi di corpi di mRNA: 1. Le singole molecole di mRNA si diffondono nel citoplasma e rappresentano l’RNA maturo e 2. Un massimo di due focolai nucleari luminosi corrispondono al trascritto nascente e rivelano gli alleli trascrizionalmente attivi23. Pertanto, smFISH è un metodo di scelta per la quantificazione di singole molecole di mRNA, studiando la loro distribuzione spaziale e fornendo istantanee della dinamica trascrizionale del gene.
Il metodo smFISH si basa su una serie di brevi sonde a oligonucleotide fluorescenti specificamente progettate per essere complementari al trascritto target. Dopo la ricottura, genera sorgenti puntiformi ad alta intensità che consentono la rilevazione di mRNA a livello di singola molecola utilizzando la microscopia confocale24. Questo metodo è sempre più applicato per un’ampia varietà di tipi di cellule, compresi i tessuti muscolari dei mammiferi19,20. Tuttavia, in Drosophila, come in altri modelli animali, la maggior parte delle conoscenze sull’espressione genica del muscolo adulto deriva da saggi molecolari di massa, che mancano di informazioni quantitative sulla posizione spaziale delle molecole di mRNA. Qui abbiamo ottimizzato un metodo per l’esecuzione di smFISH su cellule precursori muscolari e muscoli adulti di Drosophila 23,25. Questo protocollo include una pipeline di analisi completamente automatizzata per la segmentazione dei nuclei e il conteggio e la localizzazione dell’mRNA.
L’applicazione del metodo smFISH ha guadagnato popolarità negli ultimi tempi, con il suo utilizzo che si estende a vari tipi di cellule e organismi modello. Tuttavia, nel caso della Drosophila, la maggior parte delle conoscenze sull’espressione genica del muscolo adulto deriva da saggi molecolari di massa, che non riescono a fornire informazioni quantitative sulla precisa posizione spaziale delle molecole di mRNA. Per colmare questa lacuna, abbiamo ottimizzato un metodo per l’esecuzione di smFISH su cellule precursori muscolari e muscoli adulti di Drosophila . Questo approccio è stato adattato da un protocollo23 precedentemente pubblicato e ottimizzato per i tessuti muscolari di Drosophila .
Il principale ostacolo nell’ottenere immagini smFISH di alta qualità è lo spessore dei muscoli adulti, che ostacola la penetrazione ottimale delle sonde. Pertanto, è fondamentale separare i muscoli adulti dagli altri tessuti dell’animale ed eseguire il processo di ibridazione con una leggera agitazione. Questo particolare passaggio garantisce un’efficace permeabilizzazione dei tessuti.
Un altro aspetto critico è che il rapporto segnale/rumore può causare il fallimento della pipeline computazionale nel rilevare determinati punti di mRNA. Abbiamo scoperto che l’aumento del rapporto segnale/rumore può essere ottenuto trovando la concentrazione ottimale delle sonde. La diluizione ottimale può variare a seconda della composizione di ciascun set di sonde, compresa la composizione del colorante coniugato e dell’oligonucleotide. Si consiglia di provare diverse diluizioni; una diluizione finale di 200 nM ha prodotto il miglior rapporto segnale-rumore per i tessuti adulti in questi esperimenti.
Con il metodo smFISH, è possibile quantificare il numero di RNA di nuova sintesi nei focolai TS. Quando un gene viene trascritto attivamente, più RNA nascenti vengono prodotti contemporaneamente nella TS. Di conseguenza, l’intensità del TS supererà quella dell’RNA citoplasmatico maturo e questa caratteristica, combinata con la sua localizzazione nucleare, può differenziare il TS dai singoli RNA citoplasmatici. Nel contesto della biologia muscolare, il rilevamento e la quantificazione della TS sono particolarmente importanti per determinare la sincronizzazione della trascrizione di un gene specifico tra i nuclei muscolari all’interno dello stesso sincizio. Tuttavia, questa pipeline computazionale non è progettata per differenziare tra segnali citoplasmatici di mRNA e TS. In alternativa, suggeriamo di combinare questo metodo smFISH con altri strumenti di analisi smFISH ben consolidati, come BayFISH o FISH-quant29,30. È stato dimostrato che questi strumenti facilitano la segmentazione automatizzata e i calcoli dell’intensità di fluorescenza degli aggregati di RNA con notevole precisione.
Infine, mentre smFISH rileva le molecole di mRNA con un’elevata risoluzione spaziale, si limita ad analizzare un piccolo numero di mRNA contemporaneamente. Metodi multiscala come merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) consentono l’analisi simultanea di un gran numero di mRNA31 diversi. Combinando sonde di oligonucleotidi e codici di correzione degli errori, questo metodo facilita il rilevamento di centinaia di specie di RNA in singole cellule.
The authors have nothing to disclose.
Si ringrazia Alain Vincent per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo Ruth Lehmann per averci fornito l’anticorpo Zfh1. Ringraziamo Stephanie Dutertre e Xavier Pinson per la microscopia confocale presso la MRic Imaging Platform. EL è sostenuto da una borsa di dottorato del ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA è supportato dalla borsa di dottorato AFM-Telethon 23846. TP è finanziato da una sovvenzione DAF dell’iniziativa Chan Zuckerberg a T.P. (2019-198009). HB è supportato dal CNRS, dal programma Atip Avenir e dalla sovvenzione AFM-Telethon 23108 per il trampolino.
Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
Mef2 antibody | DHSB | NA | |
PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
Stellaris probes | LGC | NA | |
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |