在这里,我们描述了微加工垂直取向碳纳米纤维 (VACNF)、将 VACNF 转移到柔性基材上以及将 VACNF 应用于植物的刚性和柔性基材以进行生物分子和染料递送的方法。
将生物分子和不透水染料输送到完整的植物中是一项重大挑战。纳米材料是将DNA递送至植物的新兴工具。尽管这些新工具令人兴奋,但它们尚未得到广泛应用。在刚性基材(背衬)上制造的纳米材料特别难以成功应用于弯曲的植物结构。本研究描述了微加工垂直排列的碳纳米纤维阵列并将其从刚性基板转移到柔性基板的过程。我们详细介绍并演示了这些纤维(在刚性或柔性基材上)如何用于瞬时转化或染料(例如荧光素)递送至植物。我们展示了如何将 VACNF 从刚性硅衬底转移到柔性 SU-8 环氧树脂衬底以形成柔性 VACNF 阵列。为了克服SU-8的疏水性,柔性薄膜中的纤维涂有一层薄薄的氧化硅层(2-3nm)。为了将这些纤维输送到弯曲的植物器官,我们将 1 μL 染料或 DNA 溶液液滴沉积在 VACNF 薄膜的纤维侧,等待 10 分钟,将薄膜放在植物器官上,并使用滚动运动的拭子将纤维驱动到植物细胞中。通过这种方法,我们已经在具有曲面的植物器官中实现了染料和DNA的递送。
植物转化(瞬时和稳定)尚未在所有植物组织和物种中广泛实现。植物的瞬时转化是质粒中编码的基因暂时导入植物但不能稳定地掺入基因组的过程。使用颗粒轰击、农杆菌、电穿孔或聚乙二醇处理原生质体的传统方法速度慢或可能很麻烦。此外,它们并不适用于所有植物物种1、2、3、4。使用纳米材料进行 DNA 递送是一个新兴领域,仍处于起步阶段5.纳米材料,特别是碳纳米纤维,也已成功用于将蛋白质、葡聚糖和染料输送到植物叶子,而不会引起伤口反应6。这项工作的目标是提供一种详细的协议,用于使用一种纳米材料,即碳纳米纤维,将生物分子或染料输送到植物。在这里,我们专注于DNA作为首选的生物分子,它允许各种植物器官中的细胞瞬时转化。
此前,Morgan等人7 展示了使用附着在刚性硅衬底上的碳纳米纤维来瞬时转化生菜, 本氏猪笼草 和杨树的叶子,以及拟南芥的叶子和根。尽管在各种器官上都取得了成功的转化,但纤维更难应用于具有弯曲表面的植物组织,例如根或果实。我们推断,纳米纤维的柔性背衬可能会通过更好地符合器官的形状来提高其输送效率。
在此,我们详细介绍了用于制造和设计垂直排列的碳纳米纤维、将 VACNF 转移到柔性基质以及将 VACNF 应用于植物的刚性和柔性基质以递送生物分子和染料的方法。采用直流催化等离子体增强化学气相沉积(dc C-PECVD)和Ni催化剂制备了碳纳米纤维。如Melechko等人所述,使用电子束光刻、金属蒸发和剥离过程的组合来控制Ni催化剂点的位置、直径和高度8,9。使用双层电子束光刻胶,可以在基底上沉积较厚的镍催化剂,以产生更长的纤维10。纤维从刚性基板到柔性基板的转移基于对Fletcher等人11中描述的方法的修改,目前的方法放弃了使用无定形碳层或牺牲光刻胶层。SU-8 通过纤维转移的升空是通过利用 SU-812,13,14 烘烤不足和曝光不足产生的固有拉伸应力来实现的。SU-8 是一种复杂的聚合物,具有天然疏水性,这使得其难以用于促进 DNA 递送。为了抵消SU-8的疏水性,我们在纤维嵌入SU-8后,通过原子层沉积15施加一层薄薄的氧化硅。在刚性基材上应用纤维进行生物分子/染料递送利用了 Davern 等人 6 中描述的镊子攻丝的冲击力以及 Morgan 等人 7 中描述的植物上和芯片上方法。柔性VACNF薄膜通过首先将薄膜上的DNA或染料液滴半干燥,如Morgan等人7的芯片方法,然后使用小型化妆涂抹器16,17在弯曲的植物表面上滚动薄膜,将柔性VACNF薄膜应用于弯曲的植物表面。图 1 描述了将刚性和柔性基材中的纤维应用于植物的各种方法。
在本文中,我们提出了构建垂直排列的碳纳米纤维阵列的方法,将纤维转移到柔性基质上,并将纤维在刚性或柔性基质中应用于植物,用于将生物分子或染料递送给植物。我们描述了两种通用方法,即片上方法和工厂上方法,用于沉积引入的材料,并展示了在刚性基板上的纤维以及使用VACNF薄膜的片上方法的成功结果。这些纤维的应用在实践和理论上比传统的植物转化方法(粒子轰击、通过PEG或电穿孔的原生质体转化)更简单,可用于对农杆菌介导的转化不敏感的植物。然而,只有少数细胞被转化。
垂直排列的碳纳米纤维是在橡树岭国家实验室纳米相材料科学中心通过其用户程序生产的。用户可以申请使用该设施生产VACNF。或者,VACNF芯片可以在洁净室中使用带有碳源的直流等离子体增强化学气相沉积机生产22,23。使用所描述的方法,有几个步骤对于纤维的生产、纤维转移和 VACNF 芯片/薄膜的应用至关重要。要使纤维应用起作用,纤维必须是直的,并且在尖端具有 <200 nm 的锥形直径才能成功输送到植物细胞中 6,7(图 3)。为了制造特定尺寸和间距的碳纳米纤维,可以改变多种参数,包括网点大小、横向间距和沉积的催化剂量。为了选择用于碳纳米纤维生产的最佳网点尺寸,从各种网点尺寸生长纤维(如图5所示)。我们发现直径为 300 nm 的光纤效果最好,因此选择了这种网点尺寸(图 5)。在找到正确的参数后,我们希望使用具有 >50% 光纤且具有理想几何形状(直且尖端直径 <200 nm)的芯片。为了检查纤维的几何形状,我们使用扫描电子显微镜对VACNF芯片/薄膜样品的随机视场进行成像。
此外,纤维必须具有一定的最小长度才能在植物细胞内实现输送。生产不同长度纤维的重要性在于,可以使用更长的纤维来穿透更深的组织层。较长的纤维(长度>40 μm)对于柔性薄膜至关重要,因为纤维转印的工作原理是将纤维从其基部折断,并且需要在纤维顶部分层SU-8。用于该协议的SU-8层的工作厚度为20-35μm。在各种植物(弯曲或扁平)的表皮内完成输送所需的最小高度为 10-15 μm 6,7。因此,长度为 >40 μm 的纤维是 VACNF 薄膜所必需的。在生产碳纳米纤维时,需要考虑几个不同的参数:催化剂材料、催化剂几何形状、催化剂材料的厚度以及PECVD腔内的条件(气体比、压力、温度、电流、喷淋头高度和生长时间)8,9,24,25。为了生产Morgan等7和Davern等6使用的长度超过25 μm的碳纳米纤维,我们增加了Ni催化剂的用量,改变了乙炔氨的比例,并增加了电流和生长时间。此外,我们更加关注催化剂材料的几何形状。为了产生高大的直纤维,沉积的催化剂需要具有曲棍球形状,而不是类似于火山的形状(图4)。火山结构是由升空后光刻胶的残余物产生的。为了防止火山的形成,在电子束光刻过程中使用双层PMMA来形成底切26。底切有助于沉积金属催化剂的剥离(图2)。催化剂的厚层对于高VACNFs的生长很重要。Merkulova等人24研究了VACNFs的形态。VACNF的垂直排列是由于Ni催化剂尖端型生长和垂直于衬底的直流电位排列(图6)。喷淋头描述了PECVD反应器的几何形状(图6),并作为电场电位的来源27。
为了用电子束光刻技术定义催化剂点阵列,我们应用了电子束光刻胶(聚甲基丙烯酸甲酯),然后使用电子束在光刻胶上以特定形状和特定位置在光刻胶上打小孔。将所需直径的孔放置在具有定义间距(间距)的规则网格上,并在将基板加载到机器之前将指定所需图案的文件加载到电子束光刻工具中。除了纤维高度外,纤维转移成功的另一个关键参数是在丙酮浴中花费的时间。VACNF薄膜需要在丙酮浴中放置足够长的时间,以使其边缘开始卷曲;如果它们在丙酮浴中放置的时间太短,它们就更难从芯片上取下,并且可能会破裂。芯片越老,它们在丙酮浴中停留的时间就越长。在丙酮浴之后,将薄膜/芯片置于异丙醇和水中以除去接触丙酮并去除纤维上的保护性光刻胶。
为了进行旋涂,将晶圆或晶圆片放置在旋涂机的真空吸盘上,并使用旋涂机的测试功能验证晶圆的中心位置。将光刻胶的小水坑(直径~2.5 cm)施加到晶圆的中心并纺丝(3000 rpm,持续45秒) 图8中包括纺涂前后的纤维图像,显示了纤维几何形状(高度、方向和间距)的保存情况。纤维的存在会导致光刻胶在纤维底部涌出,并导致层比预期的更厚。VACNF生长后的旋涂已被其他组探索11,18。
该工艺中另一个至关重要的步骤是确保对VACNF芯片/薄膜施加适量的力。输送机制依赖于纤维通过镊子在刚性基质 6,7 上敲击的冲击力或在柔性基质上使用迷你化妆涂抹器滚动在细胞壁上进行小穿刺。纤维可能会也可能不会断裂并保持嵌入植物细胞6,7 而不会影响结果,但结合检查染料吸收和组织损伤的练习对于获得正确的压力是必要的。此外,在使用 VACNF 芯片/薄膜递送 DNA 后选择适当的成像时间点也很重要,因为可检测表达的时间因植物物种和递送载体类型而异7(图 16)。
尽管这种方法广泛适用于植物,但它有一些局限性。例如,在VACNF薄膜中添加一层薄薄的氧化硅并不总是导致薄膜完全亲水,因为在SU-8的顶部添加了光刻胶保护层。如果这个问题成为现实,则可以将更厚的氧化硅层应用于VACNF。为了测试薄膜是疏水的还是亲水的,可以将它们放入水中。如果薄膜下沉,它们是亲水的,如果它们漂浮,它们是疏水的。此外,生产的纤维批次之间可能存在差异。在直流-PECVD机器中生长光纤时,有几个参数可以改变;该协议中描述的是两种不同量的Ni催化剂的一组参数。此外,Ni催化剂的晶体取向无法控制28 ,一些支化将不可避免地导致纤维的产生。
虽然我们在本文中展示了使用刚性和柔性底物将荧光素染料和 DNA 递送至植物细胞,但该方法应广泛适用于其他生物分子和基因修饰方法,例如,用于苹果或其他水果等植物系统的 RNAi 沉默,在这些系统中,产生稳定的转基因系需要数年时间。此外,这些纤维还可用于递送遗传编辑材料或用于植物的稳定转化。
The authors have nothing to disclose.
纳米纤维阵列是在纳米相材料科学中心制造的,该中心是能源部科学用户设施办公室(提案ID:CNMS2019-103和CNMS2022-A-1182)。CNMS的支持是通过同行评审的提案系统授予的,并免费提供给打算发表其结果的成功申请人(http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml)。我们感谢Kevin Lester和CNMS在纳米纤维阵列生产方面的帮助。我们感谢 John Caughmen 博士、Timothy McKnight 博士、Amber Webb 博士、Daryl Briggs 和 Travis Bee 对实验设计的重要讨论。我们感谢Adam Rondinone博士提供PECVD机器的原理图。我们感谢莱斯利·卡罗尔(Leslie Carol)的科学插图。这项工作由美国能源部生物成像科学计划、科学、生物与环境研究办公室、DE-SC0019104和美国农业部资助,电话:2021-67013-34835。JMM得到了美国农业部:国家粮食和农业研究所:农业和食品研究计划博士前奖学金2021-67034-35167的支持。
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
Apples | Grocery store | No product number | |
Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
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Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
Onions | Grocery store | No product number | |
Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
Strawberries | Grocery store | No product number | |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |