RGBradford: Proteinquantifizierung mit einer Smartphone-Kamera

Unabhängig von der nachgelagerten Anwendung (z. B. ELISA, Enzymkinetik, Western Blotting, Proteinreinigung und Massenspektrometrie) ist die Proteinquantifizierung entscheidend für eine genaue Analyse in Life-Sciences-Laboren. Zusätzlich zu ihrer Verwendung als sekundäre Messwerte (d. h. zur Berechnung der relativen Konzentrationen von Analyten pro Proteinmasse) können Proteingehalte in einer Probe auch selbst die gewünschte Ausgabe sein. Zum Beispiel kann man sich für den Proteingehalt in Nahrungsressourcen¹ oder im Urin² interessieren. Es stehen viele Methoden zur Verfügung, um die Proteinkonzentration in Proben³ zu messen, einschließlich direkter UV-Absorptionsmesswerte⁴, Protein-Kupfer-Chelatbildung ^5,6, proteinbindende kolorimetrische Assays⁷ und proteinfarbstoffbindende Fluoreszenzassays⁸. Die Relevanz der Proteinquantifizierung wird durch das Vorhandensein von zwei Arbeiten, die Proteinmessmethoden beschreiben, ^5,7 in den Top-3 der meistzitierten Literatur^{belegt 9,10}. Trotz der Tatsache, dass viele Autoren ihr tatsächliches Zitieren vernachlässigen, indem sie nicht-primäre Referenzen zitieren oder überhaupt nichts zitieren, belaufen sich die Originalarbeiten, die den Lowry-Protein-Assay und den Bradford-Protein-Assay beschreiben, auf jeweils >200.000 Zitate^.

Die Popularität des Bradford-Assays beruht auf seiner Erschwinglichkeit, Einfachheit, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit. Der Assay basiert auf der Wechselwirkung zwischen Proteinen und dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G unter sauren Bedingungen. Unter den Bedingungen des Assays (d. h. niedriger pH-Wert) liegt der Farbstoff in drei Formen vor: einer roten kationischen Form mit λmax bei 470 nm; eine grüne neutrale Form mit λmax bei 650 nm; und eine blaue anionische Form mit λmax bei 590 nm ^11,12 (Abbildung 1). Die kationische Form überwiegt in Abwesenheit von Proteinen. Wenn Proteine mit dem Farbstoff interagieren, stabilisieren sie die blaue anionische Form, was zu einer deutlichen Veränderung der Farbe der Lösung von bräunlich zu blau führt. In der Regel wird die Konzentrationsänderung der blauen Form des Farbstoffs spektrophotometrisch quantifiziert, dessen Absorption bei 590-595 nm proportional zur Proteinmenge im Assay ist.

Abbildung 1: Coomassie-Absorptionsspektren für leuchtend blaues G unter den Bedingungen des Bradford-Assays. Die drei Hauptpeaks sind mit Pfeilen markiert, die das λmax der roten (470 nm), grünen (650 nm) und blauen (590 nm) Formen des Farbstoffs anzeigen. Die Spektren wurden in Abwesenheit von Protein (gelbe Linie) und in Gegenwart von 3 μg (graue Linie) und 10 μg (blaue Linie) Rinderserumalbumin aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die weit verbreitete Verwendung des Bradford-Assays hat zur Identifizierung mehrerer Einschränkungen geführt (z. B. unterschiedliche Reaktionen auf verschiedene Proteine¹¹ und Interferenz durch Lipide¹³ und Detergenzien⁷) und zur Entwicklung von Modifikationen zur Verbesserung seiner Leistung (z. B. Zugabe von Detergenzien^14,15, Alkalisierung^14,16 und Verwendung des Verhältnisses von Absorptionen¹⁷). Neben Modifikationen des Assays selbst wurde auch die Verwendung alternativer Geräte wie Smartphones oder Kameras zur Erfassung analytischer Signale beschrieben 18,19,20. In der Tat ist die Entwicklung von Methoden, die Smartphones als tragbare chemische Analysatoren nutzen, ein aktives Forschungsgebiet. Die Motivation für die Verwendung von Smartphones ergibt sich aus der Erschwinglichkeit, Portabilität, Benutzerfreundlichkeit und weit verbreiteten Verfügbarkeit dieser Geräte.

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Proteinquantifizierung mit dem RGBradford-Assay²⁰ vor, der ein Smartphone als Analysegerät verwendet. Im Gegensatz zur ursprünglichen RGBradford-Veröffentlichung²⁰ wurde hier ein Verfahren eingeführt, das den Farbextraktionsprozess rationalisiert. Es beinhaltet die Verwendung einer frei verfügbaren Softwareanwendung, um Farbinformationen aus jeder Vertiefung eines Mikroplattenbildes automatisch zu extrahieren, was viel Zeit und Mühe spart. Dies ist eine Alternative zu dem vorherigen Verfahren des manuellen Erfassens von Farbdaten aus jeder Vertiefung einzeln unter Verwendung einer Grafikeditor-Softwareanwendung²⁰. Letztendlich kann der Proteingehalt in Proben anhand von Farbdaten quantifiziert werden, die aus einem mit einem Smartphone aufgenommenen Bild einer Mikroplatte extrahiert werden.