Summary

Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto

Published: July 28, 2023
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l’imaging del calcio a due fotoni nel prosencefalo dorsale di zebrafish adulto.

Abstract

Il pesce zebra adulto (Danio rerio) mostra un ricco repertorio di comportamenti per lo studio delle funzioni cognitive. Hanno anche un cervello in miniatura che può essere utilizzato per misurare le attività nelle regioni del cervello attraverso metodi di imaging ottico. Tuttavia, i rapporti sulla registrazione dell’attività cerebrale nel comportamento del pesce zebra adulto sono stati scarsi. Il presente studio descrive le procedure per eseguire l’imaging del calcio a due fotoni nel prosencefalo dorsale di zebrafish adulti. Ci concentriamo sulle misure per impedire al pesce zebra adulto di muovere la testa, il che fornisce stabilità che consente la scansione laser dell’attività cerebrale. Gli animali con la testa trattenuta possono muovere liberamente le parti del corpo e respirare senza aiuti. La procedura mira a ridurre i tempi dell’intervento chirurgico di poggiatesta, ridurre al minimo il movimento cerebrale e massimizzare il numero di neuroni registrati. Qui viene descritta anche una configurazione per presentare un ambiente visivo immersivo durante l’imaging del calcio, che può essere utilizzata per studiare i correlati neurali alla base dei comportamenti attivati visivamente.

Introduction

L’imaging a fluorescenza del calcio con indicatori geneticamente codificati o coloranti sintetici è stato un potente metodo per misurare l’attività neuronale negli animali comportamentali, inclusi primati non umani, roditori, uccelli einsetti. L’attività di centinaia di cellule, fino a circa 800 μm sotto la superficie cerebrale, può essere misurata simultaneamente utilizzando l’imaging multi-fotone 2,3. L’attività di specifici tipi cellulari può anche essere misurata esprimendo indicatori di calcio in popolazioni neuronali geneticamente definite. L’applicazione del metodo di imaging per modelli di piccoli vertebrati apre nuove possibilità nel campo del calcolo neuronale in tutte le regioni del cervello.

I pesci zebra sono un sistema modello ampiamente utilizzato nella ricerca neuroscientifica. Le larve di pesce zebra a circa 6 giorni dopo la fecondazione sono state utilizzate per l’imaging del calcio a causa del loro cervello in miniatura e del corpo trasparente4. I giovani pesci zebra (3-4 settimane di vita) sono utilizzati anche per studiare i meccanismi neurali alla base delle vie sensomotorie 5,6. Tuttavia, il livello massimo di prestazione per i comportamenti complessi, compreso l’apprendimento associativo e i comportamenti sociali, viene raggiunto a un’età più avanzatadi 7,8 anni. Pertanto, è necessario un protocollo affidabile per studiare molteplici funzioni cognitive nel cervello del pesce zebra adulto utilizzando metodi di imaging. Mentre la larva di zebrafish e il pesce zebra giovane possono essere incorporati nell’agarosio per l’imaging in vivo, il pesce zebra adulto di 2 mesi o più soffre di ipossia in tali condizioni e sono fisicamente troppo forti per essere trattenuti dall’agarosio. Pertanto, è necessaria una procedura chirurgica per stabilizzare il cervello e consentire all’animale di respirare liberamente attraverso le branchie.

Qui, descriviamo un protocollo di poggiatesta che prevede un nuovo design di una singola barra per la testa. Il tempo di intervento ridotto di 25 minuti è due volte più veloce rispetto al metodoprecedente 9. Descriviamo anche il design della camera di registrazione (serbatoio semi-esagonale), lo stadio di testa e un meccanismo di bloccaggio rapido per combinare le due parti9. Infine, viene anche descritta la configurazione per presentare uno stimolo visivo immersivo per studiare l’attività cerebrale e i comportamenti attivati visivamente. Nel complesso, le procedure qui descritte possono essere utilizzate per eseguire l’imaging del calcio a due fotoni in popolazioni cellulari geneticamente definite in un pesce zebra adulto con la testa trattenuta, consentendo lo studio delle attività cerebrali durante vari paradigmi comportamentali.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali dell’Academia Sinica. I dettagli degli strumenti di ricerca sono disponibili nella Tabella dei materiali. 1. Preparazione della camera di registrazione Preparare un serbatoio semiesagonale, una piastra di base e uno stadio di testa (Figura 1A; Fascicoli s…

Representative Results

Il protocollo si compone di due parti: l’intervento chirurgico del poggiatesta e l’imaging a due fotoni delle attività neuronali nel prosencefalo. Il successo dell’intervento chirurgico è definito dalla sopravvivenza dell’animale e dalla stabilità del poggiatesta. Il tasso di sopravvivenza può essere notevolmente migliorato dalla frequente perfusione della soluzione TMS allo 0,01% attraverso la bocca durante l’intervento chirurgico. I pesci dovrebbero riprendersi dall’anestesia e respirare attivamente entro 1-2 minut…

Discussion

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per trattenere la testa del pesce zebra adulto per l’imaging del calcio a due fotoni. Ci sono due passaggi critici per ottenere un poggiatesta sufficientemente stabile per l’imaging a scansione laser. Innanzitutto, la barra della testa deve essere incollata ai siti di attacco specifici dei teschi. Altre parti del cranio sono spesso troppo sottili per fornire stabilità meccanica e possono anche essere fratturate durante i forti movimenti del corpo. In secondo luogo, la pelle sop…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dall’Istituto di Biologia Molecolare, dall’Academia Sinica e dal Consiglio Nazionale per la Scienza e la Tecnologia di Taiwan. L’officina meccanica dell’Istituto di Fisica dell’Academia Sinica ha contribuito alla fabbricazione di parti progettate su misura. Vogliamo anche ringraziare P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basilea, Svizzera) per la progettazione del meccanismo di bloccaggio rapido dello stadio di testa.

Materials

Acquisition card MBF Bioscience Vidrio vDAQ Microscope
Back-projection film Kimoto Diland screen – GSK present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm) Chroma ET510/80m Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Camera filter (<875 nm) Edmund optics #86-106 Behavior recording
Camera filter (>700 nm) Edmund optics #43-949 Behavior recording
Camera lens Thorlabs MVL50M23 Behavior recording
Chameleon Vision-S Coherent Vision-S Laser
Circular plate for the head stage custom made see supplemental files recording chamber
Controller for piezo actuator Physik Instrumente  E-665. CR Microscope
Current amplifier Thorlabs TIA60 Microscope
Elitedent Q-6 Rolence Enterprise Q-6 Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm Chroma ET510/80m Microscope
Head bar custom made see supplemental files recording chamber
Infrared light Thorlabs M810L3 Behavior recording
LED projector AAXA P2B LED Pico Projector present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe) Kimtech Science 34155 Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage Zaber X-LRM050 Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission) Thorlabs NE203B present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder ThorLabs PH1.5V Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post ThorLabs TR150/M Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA Nikon CF175 Microscope
Oil-based modeling clay Ly Hsin Clay C4086 Surgery: head bar holder
Optical adhesive Norland Products NOA68 Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube Hamamatsu H11706P-40 Microscope
Piezo actuator Physik Instrumente  P-725.4CA PIFOC Microscope
Pockels Cell Conoptics M350-80-LA-BK-02 Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm) Edmund optics #53-699 present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System INSS RGE-02 Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs RA90/M Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs SWC/M Surgery: fish loading module
ScanImage MBF Bioscience Basic version Microscope
Semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Super-Bond C&B Kit Sun Medical Co. Super-Bond C&B Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich E10521 Surgery: anesthetic
USB Camera FLIR BFS-U3-13Y3M-C Behavior recording
Vetbond 3M 1469SB Surgery: tissue glue

Riferimenti

  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  3. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  4. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
  5. Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
  6. Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
  7. Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
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Citazione di questo articolo
Bandonil, J. S., Liao, Y., Fathi, A., Huang, K. Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65526, doi:10.3791/65526 (2023).

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