在这里,我们提出了一种使用光透射聚集法标准化血小板激动剂胶原相关肽交联 (CRP-XL) 的方法。虽然该方案针对的是血小板功能,但实验过程可以应用于大多数生物分子和生物测定,以确保科学的严谨性和可重复性。
计量学 – 测量科学 – 是很少有生物科学家在培训中被教导的学科,这对他们不利;将简单的标准化流程应用于日常工作实践,可以提高数据的可信度以及随距离和时间变化的可重复性。
该方法演示了如何标准化止血研究和临床实践中广泛使用的核心实验室实验,特别是通过透光聚集法 (LTA) 测量对血小板胶原受体(糖蛋白 [GP]VI)激动剂胶原相关肽交联 (CRP-XL) 的反应。使用这种方法将确保实验室内的可重复性和实验室间的协调,无论激动剂库存或供应商如何。重要的是,这种方法适用于其他血小板激动剂,实际上也适用于许多其他生物分子和生物测定。
下面概述的过程包括制作“标准品”和“测试品”(您正在检查的材料)的 6-8 点稀释系列,并在选定的测定(在本例中为 LTA)中并排运行它们。CRP-XL 在质量/体积浓度下使用,但并非每种材料在给定浓度下都具有相同的生物活性,因此进行稀释系列以比较标准品和测试材料,并确定提供等效活性所需的浓度。稀释系列必须跨越 0-100% 的聚集。使用非线性回归绘制数据,并确定每个样品(标准品和测试品)的EC50 值。要分配活性,请将标准品的 EC50 值除以测试值,以确定其效力或多或少,并相应地调整浓度。这种方法将确保一次又一次地将相同的生物“活性”添加到测定中。
我们中的许多人在实验中使用生物激动剂和拮抗剂,最常见的是在生物测定中,该测定量化了它们在特定条件下对细胞功能的影响。这里描述的方法适用于血小板激动剂胶原相关肽交联 (CRP-XL),这是一种激活血小板的糖蛋白 VI 激动剂,其活性可以在各种测定法(光透射聚集法、显微镜、流式细胞术、Ca2+ 释放等)中测量,但激动剂标准化方案适用于任何生物激动剂/拮抗剂和/或生物测定法。物理科学精通在日常工作实践中使用标准,在商业领域开发生物治疗药物的公司了解使用参考标准的价值1,但许多生物科学家,特别是在学术研究界,它们仍然没有得到充分利用,缺乏使用会对科学产出的质量产生负面影响。
CRP-XL 是一种特异性 GPVI 特异性激动剂,自 1995 年被描述以来,血小板领域已经使用了几十年2,帮助社区自 3,4 以来将 GPVI 的作用与其他胶原结合血小板蛋白的作用区分开来。这种激动剂可以从各种商业来源采购或内部生产。肽单体可以从供应商处购买,然后在内部进行交联,也可以由供应商支付额外费用。通过降低交付时所需的纯度(例如,70% 对 95%),可以进一步节省成本。关于CRP-XL的储存方式也没有达成共识,有些选择低温储存,有些选择冷藏,有些选择将材料冻干直到使用,有些则将其储存在溶液(水或缓冲液,取决于偏好)中。因此,实验室储备的质量和组成是非标准化或协调的。由于该激动剂以规定的浓度(质量/体积)而不是活性单位使用,因此在一个实验室中,CRP-XL的效力(例如,1μg/mL)将与另一个实验室不同。值得注意的是,该领域使用的其他血小板激动剂已经标准化(例如,凝血酶,其以活性单位而不是质量/体积提供和使用),因此从质量/体积到生物单位的运动对社区来说应该不会太具有挑战性。还应该注意的是,患者对血小板激动剂(包括 CRP-XL)的反应在对激动剂的敏感性以及反应能力(反应程度)方面是可变的5,因此在测定中使用一致量的激动剂活性更为重要。
如果血小板激动剂可以通过在规定的活性而不是重量/体积下使用它们来协调,则可以确保一个实验室的实验与其他实验室的实验直接比较,并且可以放心地准确再现。在现场就如何存储和标准化 CRP-XL 活动达成一致之前,必须对材料进行定期检查,以确保其在使用月/年内的一致性。
生物标准品的活性值分配必须通过协作的多中心研究(例如6,7)完成,并且需要专业知识。最近,由国际血栓形成和止血学会 (ISTH) 支持的一项多中心合作研究8 强调了建立血小板激动剂生物学标准的必要性;在国际CRP-XL标准可用之前,研究人员可以在当地对自己的材料进行标准化,以确保长期保持一致性,并且商业或内部采购的新材料与以前的制剂以及社区其他部分的制备具有相当的活性。
如图所示,材料标准化的过程非常简单。虽然评估新批次的材料和/或检查当前批次的材料是否稳定且不会随着时间的推移而失去活性,但回报是实验可以一次又一次地重复,并且可以在数年内进行比较,而不仅仅是一批试剂的寿命。这也意味着其他研究人员可以准确地重建检测条件,并且社区在全球范围内得到协调。方案中的关键步骤包括全血采集和PRP制备9,以及进行稀释系列时的精确度。在进行 EC50 比较之前,确保测试曲线和标准曲线平行也很重要。如果线不平行,或者渐近线不等效,则可能表明测试材料和标准材料在某种程度上不同。
每个从事生物科学工作的人都知道,生物检测并不总是始终如一地执行,因此在评估数据时需要注意这一点。在这里显示的示例中,即使我们使用相同的供体来测量两种非常相似(如果不是完全相同)材料的效力,山坡和渐近线也不完全相同。然而,我们接受一定程度的可变性,并得出结论,在这种情况下,曲线是平行的,因此适合比较和调整效力。生物分子大而复杂,制造过程中的翻译后修饰会影响其在生物测定中的效力。生物分子和生物测定的标准化不能仅使用质量或体积来完成,必须通过量化和比较生物测定中的生物 活性 来完成11.必须利用他/她的培训和经验来评估分析环境中的数据。
该技术的局限性在于,虽然数据可能表明试剂存在问题,但它无法告诉您问题是什么。需要进一步的工作来确定为什么这些材料没有可比性。在理想情况下,任何对实验和随后的科学结论至关重要的材料都将通过质谱进行验证,但这并不总是一种选择。但是,如果数据不具有可比性,则仍有必要以某种身份进行进一步调查。这种方法的另一个局限性是这样做所需的时间和资源。理想情况下,应在 3-6 个供体中比较测试和标准品,以提供为材料分配生物活性的一定信心,但我们认为这可以通过支持可重复性和可靠性来证明是合理的。不需要在每次进行实验时都对生物材料进行标准化,但至少应该对每批新的激动剂进行标准化,最好更频繁地进行,具体取决于稳定性和用途。事实上,如果有一个标准可用,国际标准化组织可以对此提供澄清。
虽然这里显示的示例是在测量血小板聚集的背景下针对 CRP-XL,但在生物测定中比较生物分子生物活性的方案在整个行业中广泛适用。
The authors have nothing to disclose.
没有。
4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Prism | Graphpad | Analysis software package | |
Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |