Summary

ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

כאן אנו מתארים ייצור ואפיון של חומרים ביו-אקטיביים המכילים ננו-דיסקים. ננודיסקים של Amphotericin B נלקחים כדוגמה לתיאור הפרוטוקול בצורה מדורגת.

Abstract

המונח ננו-דיסק מתייחס לסוג בדיד של ננו-חלקיק המורכב מליפיד דו-שכבתי היוצר שומנים, חלבון פיגום וסוכן ביו-אקטיבי משולב. ננו-דיסקים מאורגנים כדו-שכבה ליפידית בצורת דיסק שהיקפו מוקף על ידי חלבון הפיגומים, בדרך כלל חבר במשפחת אפוליפופרוטאין הניתן להחלפה. חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים רבים נמסו ביעילות בננו-דיסקים על ידי שילובם בסביבה ההידרופובית של דו-שכבת השומנים של החלקיק, והניבו אוכלוסייה הומוגנית ברובה של חלקיקים בקוטר של 10-20 ננומטר. הניסוח של ננודיסקים דורש יחס מדויק של רכיבים בודדים, תוספת רציפה מתאימה של כל רכיב, ואחריו סוניקציה של תערובת הפורמולציה. חלבון הפיגום האמפיפתי בא במגע ספונטני ומארגן מחדש את תערובת השומנים/חומרים ביו-אקטיביים המפוזרים ויוצר אותם ליצירת אוכלוסייה בדידה והומוגנית של חלקיקי ננו-דיסק. במהלך תהליך זה, תערובת התגובה עוברת ממראה אטום ועכור לדגימה מזוקקת, שכאשר היא ממוטבת במלואה, אינה מניבה משקעים בצנטריפוגה. מחקרי אפיון כוללים קביעת יעילות מסיסות של חומרים ביו-אקטיביים, מיקרוסקופ אלקטרונים, כרומטוגרפיית סינון ג’ל, ספקטרוסקופיית ספיגה אולטרה סגולה גלויה (UV/Vis) ו/או ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית. זה בדרך כלל ואחריו חקירה של פעילות ביולוגית באמצעות תאים בתרבית או עכברים. במקרה של ננודיסקים המכילים אנטיביוטיקה (כלומר, אנטיביוטיקה פוליאן מקרוליד אמפוטריצין B), ניתן למדוד את יכולתם לעכב צמיחה של שמרים או פטריות כפונקציה של ריכוז או זמן. קלות הניסוח היחסית, הרבגוניות ביחס לחלקי הרכיבים, גודל החלקיקים הננומטריים, היציבות הטבועה והמסיסות המימית מאפשרים יישומים רבים במבחנה ו-in vivo של טכנולוגיית ננו-דיסק . במאמר זה, אנו מתארים מתודולוגיה כללית לניסוח ואפיון ננודיסקים המכילים אמפוטריצין B כסוכן ביו-אקטיבי הידרופובי.

Introduction

ליפופרוטאינים דיסקואידים בצפיפות גבוהה (HDLs) הם אבות טבעיים של HDL כדורי הרבה יותר נפוץ הקיים במערכת הדם האנושית. חלקיקים חדשים אלה, המכונים גם pre-ß HDL, הם בעלי תכונות מבניות ייחודיות וייחודיות1. ואכן, במקום להתקיים כחלקיק כדורי, HDL מתהווה הוא בצורת דיסק. מחקרי אפיון מבניים נרחבים על HDL דיסקואידים טבעיים ומשוחזרים גילו כי הם מורכבים מדו-שכבה פוספוליפידית שהיקפה מוקפת על ידי אפוליפופרוטאין אמפיפתי הניתן להחלפה (apo), כגון apoA-I. במטבוליזם של ליפופרוטאינים אנושיים, HDLs מתהווים במחזור צוברים שומנים מתאים היקפיים ומבשילים ל-HDL כדוריים בתהליך התלוי במתווכי חלבונים מרכזיים, כולל מעביר קלטות קושר ATP A1 ולציטין:כולסטרול אצילטרנספראז2. תהליך זה מהווה מרכיב קריטי במסלול העברת כולסטרול הפוך שנחשב כמגן מפני מחלות לב. חמושים בידע זה וביכולת לשחזר HDL דיסקואידלי, חוקרים השתמשו בחלקיקים אלה כהתערבות טיפולית לטיפול בטרשת עורקים3. בעיקרו של דבר, עירוי של HDL משוחזר (rHDL) לחולים מקדם את שטף הכולסטרול ממשקעי פלאק ומחזיר אותו לכבד לצורך המרה לחומצות מרה והפרשת מהגוף. מספר חברות ביוטכנולוגיה / תרופות נוקטות באסטרטגיית טיפול זו4.

במקביל, היכולת לייצר חלקיקים אלה במעבדה עוררה גל של פעילויות מחקר שהובילו ליישומים חדשים וטכנולוגיות חדשות. יישום בולט אחד כולל שימוש בחלקיקי rHDL כקרום מיניאטורי כדי לאכלס חלבונים טרנסממברנליים בסביבה דמוית ילידים5. עד כה, מאות חלבונים שולבו בהצלחה ב-rHDL דיסקואידלי, ומחקרים הוכיחו כי חלבונים אלה שומרים הן על קונפורמציה טבעית והן על פעילות ביולוגית כקולטנים, אנזימים, טרנספורטרים וכו’. חלקיקים אלה, המכונים “ננודיסקים”, הוכחו גם כמתאימים לאפיון מבני, לעתים קרובות ברזולוציה גבוהה6. גישה זו לחקירות של חלבונים טרנסממברנליים מוכרת כעדיפה על מחקרים עם מיצלות דטרגנטים או ליפוזומים, וכתוצאה מכך, היא מתקדמת במהירות. חשוב להכיר בכך שדווחו שתי שיטות שונות המסוגלות ליצור rHDL. שיטת “דיאליזה כולאט”13 פופולרית ליישומים הקשורים לשילוב חלבונים טרנסממברנליים בשכבה הדו-שכבתיתrHDL 5. בעיקרו של דבר, שיטת ניסוח זו כוללת ערבוב של פוספוליפיד דו-שכבתי היוצר פוספוליפיד, חלבון פיגום והחלבון הטרנסממברנה המעניין במאגר המכיל את חומר הניקוי נתרן כולאט (או נתרן דאוקסיכולאט; משקל מולקולרי של מיצלה [MW] של 4,200 Da). חומר הניקוי מסיס ביעילות את מרכיבי התגובה השונים, ומאפשר לדגימה להיות מחוייגת כנגד חיץ חסר חומר ניקוי. במהלך שלב הדיאליזה, כאשר חומר הניקוי מוסר מהדגימה, נוצר rHDL באופן ספונטני. כאשר משתמשים בגישה זו כדי ללכוד חלבון טרנסממברנה מעניין, חלקיקי המוצר כונו ננודיסקים5. ניסיונות להשתמש בשיטה זו כדי לשלב חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים של מולקולות קטנות (MW <1,000 Da), עם זאת, לא צלחו ברובם. שלא כמו חלבונים טרנסממברנליים, חומרים ביו-אקטיביים של מולקולות קטנות מסוגלים לברוח משקית הדיאליזה יחד עם חומר הניקוי, מה שמקטין מאוד את יעילות השילוב שלהם ב-rHDLs. בעיה זו נפתרה על ידי השמטת חומרי ניקוי מתערובת הפורמולציה14. במקום זאת, הרכיבים מתווספים למאגר מימי ברצף, החל מהשכבה הדו-שכבתית היוצרת שומנים, ויוצרים סוכן ביו-אקטיבי יציב המכיל rHDL, המכונה ננודיסק. אחרים השתמשו ב-rHDL לשילוב והובלה של חומרי הדמיה in vivo 7. לאחרונה, rHDL מיוחד המורכב מפיגום אפוליפופרוטאין והגליצרופוספוליפיד האניוני, קרדיוליפין, שימשו במחקרי קשירת ליגנדים. חלקיקים אלה מספקים פלטפורמה למחקרים על האינטראקציה של cardiolipin עם ליגנדות מסיסים במים שונים, כולל סידן, cytochrome c, ואת סוכן אנטי סרטני doxorubicin8.

המחקר הנוכחי מתמקד בניסוח rHDL בעל חומר ביו-אקטיבי הידרופובי משולב יציב (כלומר ננודיסק). היכולת של חומרים אלה להשתלב בסביבה השומנית של חלקיקי rHDL דיסקואידים מעניקה להם ביעילות מסיסות מימית. ככאלה, לננודיסקים יש פוטנציאל ליישומים טיפוליים in vivo . בעת גיבוש ננו-דיסקים, נדרשים תנאי דגירה/תגובה ספציפיים כדי לשלב בהצלחה חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים בדידים בחלקיק המוצר, ומטרת דוח זה היא לספק מידע מעשי מפורט שיכול לשמש כתבנית בסיסית ליצירת חלקיקי ננו-דיסק חדשניים עבור יישומים ספציפיים. לפיכך, בהקשר של כתב יד זה המונחים ננודיסק וננודיסק אינם ניתנים להחלפה. בעוד שננודיסק מתייחס ל-rHDL שנוסח להכיל חלבון טרנסממברנה המוטבעבשכבה הדו-שכבתית 5 של השומנים, המונח ננו-דיסק מתייחס ל-rHDL שנוסח לשלב משקל מולקולרי נמוך (< 1,000 Da) חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים, כגון אמפוטריצין B14.

קיימות מגוון שיטות לרכישת חלבוני פיגומים מתאימים. ניתן לרכוש חלבוני פיגומים מיצרנים [למשל apoA-I (SRP4693) או apoE4 (A3234)], אולם העלות עשויה להיות גורם מגביל. גישה מועדפת היא לבטא חלבוני פיגום רקומביננטיים ב– Escherichia coli. פרוטוקולים מתפרסמים עבור apoA-I9, apoE410 אנושי, כמו גם חלבון המולימפה אפוליפופורין-III11. לצורך הניסויים המתוארים כאן, נעשה שימוש בדומיין רקומביננטי אנושי מסוג apoE4 N-terminal (NT) (חומצות אמינו 1-183). רצף הנוקלאוטידים המקודד apoE4-NT האנושי סונתז והוכנס לווקטור ביטוי pET-22b (+) הסמוך ישירות לרצף מובילי pelB המקודד על ידי וקטור. מבנה זה מוביל לביטוי של חלבון היתוך מוביל pelB – apoE4-NT. לאחר סינתזת חלבונים, רצף מובילי pelB חיידקי מכוון את החלבון החדש המסונתז לחלל הפריפלסמי שבו פפטידאז מוביל חותך את רצף pelB. חלבון apoE4-NT המתקבל, ללא תגי רצף או זנבות, בורח לאחר מכן מהחיידקים ומצטבר בתווך התרבית11,12, מה שמפשט את העיבוד במורד הזרם.

Protocol

1. טרנספורמציה, ביטוי וטיהור של רכיב חלבון פיגום טרנספורמציה חיידקית BL21 עם apoE4-NT המכיל פלסמידהפשירו צינור של תאים מוכשרים BL21 (DE3) על קרח למשך 10 דקות. לאחר שכל הקרח נמס, ערבבו בעדינות ובזהירות פיפטה 50 μL של התאים לתוך צינור טרנספורמציה על קרח. הוסף 5 μL המכיל 50 ng של D…

Representative Results

תהליך ניסוח ננודיסק סוכן ביו-אקטיביבהליך ניסוח ampB-nanodisk המתואר, התגובה נחשבת לשלמה כאשר מראה הדגימה משתנה מעכירות לצלולה (איור 1). שינוי זה מצביע על כך שננו-דיסקים נוצרו וכי הסוכן הביו-אקטיבי היה מסיס. לעתים קרובות, חומרים ביו-אקטיביים בולעים אור באזור אורך הגל הנ?…

Discussion

ניסוח של חומר ביו-אקטיבי המכיל ננו-דיסקים מספק שיטה נוחה להמיס תרכובות הידרופוביות בלתי מסיסות אחרת. מאחר שהננו-דיסקים של הסוכן הביו-אקטיבי של המוצר מסיסים לחלוטין במדיה מימית, הם מספקים שיטת העברה שימושית למגוון רחב של מולקולות הידרופוביות (טבלה 1). אלה כוללים מולקולות קטנות, תרו…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (R37 HL-64159).

Materials

Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

Riferimenti

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Play Video

Citazione di questo articolo
Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

View Video