Het huidige protocol beschrijft de zuiveringsstappen en daaropvolgende studies van vier verschillende schimmel-β-glucanen als potentiële immunomodulerende moleculen die de anti-tumorale eigenschappen van microglia tegen glioblastoomcellen verbeteren.
Een van de grootste uitdagingen bij het ontwikkelen van effectieve therapieën tegen glioblastoom is het overwinnen van de sterke immuunsuppressie in de micro-omgeving van de tumor. Immunotherapie is naar voren gekomen als een effectieve strategie om de reactie van het immuunsysteem tegen tumorcellen te keren. Glioom-geassocieerde macrofagen en microglia (GAMs) zijn belangrijke aanjagers van dergelijke ontstekingsremmende scenario’s. Daarom kan het verbeteren van de antikankerrespons bij GAM’s een potentiële co-adjuvante therapie zijn om glioblastoompatiënten te behandelen. In die geest staan schimmel- β-glucaanmoleculen al lang bekend als krachtige immuunmodulatoren. Hun vermogen om de aangeboren immuunactiviteit te stimuleren en de behandelingsrespons te verbeteren is beschreven. Die modulerende kenmerken worden deels toegeschreven aan hun vermogen om te binden aan patroonherkenningsreceptoren, die, interessant genoeg, sterk tot expressie komen in GAMs. Dit werk is dus gericht op de isolatie, zuivering en het daaropvolgende gebruik van schimmel β-glucanen om de tumordodende respons van microglia tegen glioblastoomcellen te verbeteren. De muisglioblastoom (GL261) en microglia (BV-2) cellijnen worden gebruikt om de immunomodulerende eigenschappen te testen van vier verschillende schimmel β-glucanen geëxtraheerd uit paddenstoelen die veel worden gebruikt in de huidige biofarmaceutische industrie: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus en Ganoderma lucidum. Om deze verbindingen te testen, werden co-stimulatietests uitgevoerd om het effect van een vooraf geactiveerd microglia-geconditioneerd medium op de proliferatie en apoptose-activering in glioblastoomcellen te meten.
Ondanks de komst van nieuwe prestaties op het gebied van neuro-oncologie, blijft de levensverwachting van glioblastoompatiënten mager. Gouden standaard therapieën tegen hersentumoren zijn gebaseerd op de samensmelting van chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. In het afgelopen decennium is immunotherapie echter naar voren gekomen als een krachtige strategie om verschillende soorten kanker te behandelen1. Zo is de mogelijkheid om de immuunrespons van het lichaam tegen tumorcellen te benutten onlangs de vierde pijler van de oncologie geworden.
Het is al lang bekend dat een van de grootste uitdagingen in het veld is om de sterke immunosuppressie in de micro-omgeving van de tumorte overwinnen 2. Met name in het geval van glioblastoom, een van de meest voorkomende en agressieve vormen van hersenkanker, kan het ontrafelen van belangrijke routes die dergelijke pro-tumorale scenario’s orkestreren en het vinden van nieuwe verbindingen die de deprimerende reactie van het immuunsysteem kunnen tegengaan, de weg vrijmaken voor toekomstige therapieën tegen deze ongeneeslijke ziekte.
De hersenen bezitten hun eigen cellen van het immuunsysteem en het meest relevante celtype zijn microglia. Het is bewezen dat deze cellen een vrij complex gedrag vertonen bij verschillende centrale ziekten3. In het geval van primaire hersentumoren (bijv. Glioblastoom), worden deze cellen verschoven naar een ontstekingsremmend fenotype dat tumorcellen ondersteunt om het hersenparenchym te koloniseren3. Talrijke publicaties hebben de belangrijke rol van deze cellen tijdens tumorprogressie versterkt. Een van de belangrijkste redenen hiervoor is dat glioom-geassocieerde microglia en geïnfiltreerde macrofagen (GAMs) goed zijn voor een derde van de totale tumormassa, wat de ondubbelzinnige invloed van hun activeringstoestanden tijdens de progressie van de hersentumorsuggereert 4,5.
In die geest zijn schimmel β-glucanen beschreven als krachtige moleculen die effectieve immuunresponsen veroorzaken, waaronder fagocytose en pro-inflammatoire factoren productie, wat leidt tot de eliminatie van schadelijke stoffen 6,7,8,9,10. Schimmel β-glucanen zijn over het algemeen bestudeerd met behulp van extracten van verschillende paddenstoeldelen. De toekenning van specifieke effecten vereist echter de zuivering ervan om dubbelzinnigheden te voorkomen en om het werkingsmechanisme van dergelijke moleculen als immunomodulerende middelen te kunnen begrijpen8.
In dit werk worden oplosbare β-glucanen gezuiverd uit het vruchtlichaam van vier verschillende paddenstoelen, regelmatig gebruikt als eetbare (Pleurotus ostreatus en Pleurotus djamor) en als medicinale (Ganoderma lucidum en Hericium erinaceus) paddenstoelen. Met name deze vier paddenstoelen worden veel gebruikt in de voedings- en farmaceutische industrie en werden geproduceerd binnen een milieuvriendelijke circulaire economie in een commerciële onderneming (zie Materiaaltabel).
Om de basis te leggen voor het toekomstige gebruik van schimmel-β-glucanen in hersenkankertherapieën, zijn goed gedefinieerde zuiveringsstrategieën en preklinische studies die zich verdiepen in hun vermeende interactie met cellen van het immuunsysteem essentieel om hun potentiële rol als antitumormediatoren te evalueren. Dit werk beschrijft de talrijke stappen van isolatie en zuivering die nodig zijn om de oplosbare β-glucanen in de vruchtlichamen van de geselecteerde paddenstoel terug te halen. Eenmaal met succes gezuiverd, worden microgliacellen geactiveerd om hun inflammatoire fenotype te verbeteren. Muis glioblastoom cellen (GL261) worden gecoat met een ander microglia-geconditioneerd medium, eerder behandeld met deze extracten, en vervolgens wordt het effect ervan op het gedrag van tumorcellen geëvalueerd. Interessant is dat pilotstudies van ons laboratorium (gegevens niet getoond) hebben blootgelegd hoe pro-inflammatoire microglia de migratie van tumorcellen en invasie-eigenschappen kunnen vertragen, niet alleen in glioblastoomcellen, maar ook in andere kankercellijnen. Dit multidisciplinaire werk kan een nuttig hulpmiddel zijn voor oncologische onderzoekers om veelbelovende verbindingen te testen die de immuunrespons in veel verschillende soorten tumoren kunnen stimuleren.
Dit werk beschrijft het gebruik van gevestigde technieken om met succes het gehalte aan SβG’s uit vier verschillende schimmels te isoleren, te zuiveren en te karakteriseren. De resultaten toonden aan hoe na warmwaterextractie van SMP’s, verkregen uit P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus, gevolgd door hydrolytische behandeling met α-amylase, glucosidase en protease, het gehalte aan α-glucaan en eiwit werd verminderd, waardoor de hoeveelheid zuivere SβG’s aanzienlijk w…
The authors have nothing to disclose.
We willen dr. Vasiliki Economopoulos bedanken voor haar interne script om het fuluorescence-signaal in ImageJ te meten. We willen ook de CITIUS (Universiteit van Sevilla) en al hun personeel bedanken voor hun steun tijdens de demonstratie. Dit werk werd ondersteund door de Spaanse FEDER I + D + i-USE, US-1264152 van de Universiteit van Sevilla, en het Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
H2SO4 | |||
HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |